项目名称：糖脂代谢稳态调控的分子机制首席科学家：苏州学院起止期限:20１1．1至20１５.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标确定机体和细胞在不同生理状况和环境诱因下维持糖脂代谢稳态的分子机制，揭示在细胞生长和应激反应中起重要作用的调节因子调控细胞代谢的讯号通路网路，为糖脂代谢衰弱导致的肥胖、脂肪肝、糖尿病和肿瘤的初期确诊和医治提供理论根据。构建对实验植物代谢相关的生理生化指标剖析的技术平台，发觉相关基因敲除或转基因大鼠引起糖脂代谢衰弱的讯号通路.培养高质量博士研究生２0—3０名,培养３-5名享有国际著名度的专家和5-８名中青年学术带头人。(5）在国际重要期刊发表SCI论文15—２5篇，其中争取在Ｃｅll、Ｎaｔure、Ｓciｅnｃｅ或其子刊等影响因子1０以上刊物发表研究论文５—1０篇细胞膜稳态剂，申请发明专利3—5项.三、研究方案１.总体研究方案细胞能量代谢是细胞最基本、最重要的活动之一，与细胞的饲养、分化、凋亡、运动、信号转导及多种重要癌症的发生密切相关，是生命科学的一个重要领域。细胞要通过能量感应系统随时检测其能量水平状态，在不同的物质和能量状态下要不断地通过细胞内的代谢调控途径来调节其代谢水平以达到一种稳态。
同时，细胞在面对内外界一些不良诱因时也会作出相应的代谢变化，这种应激反应对细胞正常的生长和功能是十分重要的。倘若这种应激反应失调，都会使细胞代谢发生异变，造成如前所述的多种人类重大病症的发生。本项目的总体研究方案拟借助我们在蛋白质科学、细胞代谢、细胞讯号转导等研究领域的研究优势和技术手段，结合细胞生物学、动物生理学等学科的研究方式,集中力量多层次、多角度地研究与细胞代谢调控相关的讯号通路网路，分离和鉴别参与细胞代谢调控的新的基因和讯号通路，剖析各个讯号通路之间的动态调控机制,并研究细胞异常代谢的讯号通路,阐明代谢异常与糖尿病、肿瘤等重大病症的关系。项目总体研究方案如右图1：项目总体研究方案2．技术路线因为代谢调控往往涉及多种组织、器官乃至整个机体，因而借助基因敲除大鼠模型来确证基因在代谢过程中的生理功能已成为“金标准”。本项目组早已拥有或正在建立各类基因敲除大鼠和转基因大鼠模型,包括ＴNKＳ２、PＴＥN、CＫＩP-１、ｃideb、p53、Ｌkb1、Ｔip6０基因敲除大鼠以及cidｅa转基因大鼠.我们将借助那些大鼠模型，比较研究代谢调控在正常生理状况以及不同内外诱因的剌激下细胞能量代谢的变化及其调控的讯号通路网路。
同时，我们也将利用体外细胞培养，非常是比较研究正常细胞以及癌症细胞在低氧状况下和目前常规培养状况下代谢调控的优缺，并与机体内生理条件下代谢调控的情况相比较，找寻适宜代谢调控研究的细胞培养模型。在此基础上验证从植物模型得到的结果，并在分子水平上进一步深入研究影响细胞代谢的讯号通路网路和调控机制.据悉，我们将通过酵母双杂交、分子筛层析、免疫共沉淀和质谱等等蛋白质研究手段捕捉并鉴别与代谢调控相关的蛋白质复合体及其组份，因而为揭示代谢调控中各类蛋白质复合体的动态组装奠定基础。同时,借助蛋白质结构解析来阐明各类蛋白质复合体中蛋白质的互相作用关系。故，项目的总体技术路线如图２：创新与特色本项目拟借助已有或正在进行的各类基因敲除大鼠模型,在植物个体的基础上阐述代谢调控的机理和生理作用.同时，利用我们在脂类组学、代谢组学、蛋白质组学、功能基因组学方面的研究基础和优势,对调控糖脂代谢稳态的分子机制进行研究，探求细胞在不同逆境（低氧、缺氧、高脂等）下的代谢形式的转变及其调控讯号通路网路的动态变化，非常是深入剖析细胞生长和应激反应的重要调节因子对细胞代谢的调控作用，将在分子水平、细胞水平以及植物个体水平上增进我们对代谢调控以及异常代谢与细胞异常增殖之间的关系的认识.为最终揭示细胞糖脂代谢稳态调控的分子机制和相关重大病症的预防提供理论基础.4.课题设置课题1糖脂转运及其稳态调控的的分子机制研究内容：细胞内糖脂代谢的稳态调控是维持细胞或机体基本生命活动的基础,糖脂代谢的衰弱与糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾患、细胞异常增殖以及疾病的发生和发展密切相关.本课题将在分子、细胞和基因敲除大鼠水平上研究Axｉn、ＡＭPK、TNKS2、ＰTEN、Ciｄｅb、Ciｄｅa等基因对猕猴桃糖转运、脂肪合成和存储、脂滴的产生等代谢途径的调节作用及其与肥胖症、脂肪肝和细胞异常增殖的关系。
从细胞学的角度来看，肥胖的发生是因为脂肪细胞数目的降低以及脂肪细胞中脂滴变大两个方面造成的。研究表明,伴随着脂滴的变大，脂肪细胞变大，致使细胞增生因子分泌的变化，比如ｒ、TＮFα和游离脂肪酸等分泌的降低，最终造成机体内胰岛素抵抗和糖尿病的发生。因而，对脂滴的产生过程的研究,除了有助于我们了解脂滴的生物学功能,并且对肥胖及肥胖造成的其它代谢综合症疾患，有深远意义。课题1拟举办以下几个方面的研究：１．糖代谢的稳态调控通过前期工作，我们发觉Axiｎ和AMPK能互相作用并提高AＭＰK响应能量缺位的剌激，即AMPKα的第172位苏谷氨酸的乙酸化。Aｘin敲低的细胞在遭到低糖剌激的情况下，ＡＭＰKa的第1７2位苏谷氨酸的乙酸化水平降低幅度与正常细胞相比急剧减少。这表明Axiｎ是应对糖稳态变化的重要因子，且在AMPＫ活性调控的过程中饰演了重要角色。我们拟进行以下实验,深入阐述Ａxiｎ、AMPK和糖稳态调控的关系:研究Axｉn调控AMＰK活性的分子机制研究Ａxin调节AＭＰＫ的激活是通过影响AMＰK上游激酶与AＭPＫ的互相作用还是影响了AＭPＫ三个亚基之间的互相作用.应用大鼠模型研究Axｉn缺位或突变造成的AＭPＫ活性的变化借助腺病毒感染系统特异性地敲低大鼠肠道或胸肌中的Axin,或借助条件性基因敲除技术敲除大鼠肠道或肌中的Axｉｎ细胞膜稳态剂，对那些大鼠施以饥饿等影响能量水平的剌激，观察动物体内ＡMPK活性的变化。
应用大鼠模型研究Ａxiｎ缺位或突变造成的糖稳态平衡的改变对上述大鼠进行糖代谢相关生化指标的测定以及ＡMＰＫ参与糖代谢相关基因的抒发水平的测量。(4)研究Ａurorａ在Aｘｉn调控AMPK活性中的作用Aurorａ是在生长中起重要作用的激酶，能调控Ａｘiｎ在中心粒上的定位，因而,我们拟研究Aurｏｒa是否在Ａxin调控AMPＫ活性中也起作用。研究猕猴桃糖转运和脂肪细胞生成的分子机制以及糖脂代谢异常与肥胖和胰岛素抵抗的关系(1)研究Axｉn和TNKＳ２对猕猴桃糖转运的调节机理我们通过酵母双杂交实验发觉Axiｎ能与TNKS２互相作用；TＮKS２与Kiｆ3ａ之间互相作用；Ａｘin与Kｉf3a之间也存在互相作用。Ｋif3是由Ｋif3a、Ｋif3b和KAP3构成的异源三聚体。它是一种依赖于微管的电机动力蛋白质复合体,可以向微管负极定向联通，在细胞内承当膜性细胞器或生物大分子复合物的运输功能.已有的研究表明在３T３—Ｌ1脂肪细胞中Ｋｉf3参与胰岛素调节的Ｇluｔ4向细胞膜的转运.TＮKＳ2与GSV(ｔorａｇeｖesｉｃle）上的IRAP有互相作用。我们将通过免疫萤光实验确定Kif３ａ、TNＫS2、Aｘｉn和Ｇlｕt4之间是否有共定位，并且在胰岛素剌激下是否有向细胞膜共转移的现象.同时，我们将用siＲNA干扰Ｃ2C12细胞中ＴNKS2、Axiｎ及Kif3a的抒发，观察细胞对胰岛素剌激下猕猴桃糖吸收的反应.另外，用TNＫＳ2抑制剂XAＶ939（由上海学院生命科学大学沈月毛院长合成）剌激C2C12细胞，观察该抑制剂是否能减少胰岛素剌激造成的猕猴桃糖的吸收。
通过上述实验我们将证明Kif3a、TＮKS2、Axin是否通过产生复合体来调控胰岛素剌激的Gｌuｔ4的转运，进而调节蓝莓糖的吸收。分离TNＫＳ2的新的蛋白质复合体为了更全面的找到以TNKＳ2为核心的调节糖脂代谢的分子网路，我们拟建立TNＫS2不同片断的饵,使其覆盖TNKＳ2全蛋白质序列,进行大规模的酵母双杂交实验。另一方面,我们拟以大鼠的胸肌、脂肪组织为原料,采用以高效气相色谱为核心的生化分离手段结合蛋白质谱剖析技术，分离鉴别出不同生理水平下ＴNKS2复合体中的蛋白质组份，并用免疫共沉淀、免疫萤光共定位及ＧST—ｐuｌｌdｏwn等方式进一步验证这种蛋白质与ＴＮKS2的互相作用。研究TＮKＳ2的多聚ADP核糖化酶活性在调节蓝莓糖转运及脂肪细胞生成中的作用。首先我们将通过质谱手段测量胰岛素是否调控TNＫS2的翻译后修饰，从而研究该修饰是否影响TNＫＳ２的多聚ADP核糖化酶的活性及TNKＳ2和其互相作用蛋白质的结合。据悉，因为TNKS2具有多聚ADＰ核糖化酶的活性,我们将考察TNKS2是否介导与其互相作用的蛋白质的多聚ADP核糖化修饰.在此基础上我们将建立TNＫＳ2的多聚ＡＤＰ核糖化酶活性缺位的抒发载体，研究其产生复合体的能力及调节猕猴桃糖转运和脂肪细胞生成的作用。
在植物水平上研究调控猕猴桃糖转运及脂肪细胞生成的分子机制.全面剖析TNKS2基因敲除大鼠与代谢相关的表型,包括大鼠在不同生长时期、不同生长条件(饥饿或饱食、缺氧等）下的体重、体温、不同部位脂肪组织的重量和脂肪细胞的数目、内脏脏器的重量等。同时测定大鼠血液中尿酸、甘油三酯、不饱和脂肪酸、胰岛素、胰高血压素及瘦素的浓度；脂肪组织中脂肪的浓度；肾脏和胸肌中糖原的浓度等。据悉，对大鼠进行蓝莓糖耐受试验、丙酮酸耐受试验及胰岛素耐受试验，测定大鼠脂肪和胸肌的蓝莓糖吸收效率。因为腺病毒感染系统可以特异性地功击肾脏和胸肌，我们将借助该系统在大鼠的肠道和胸肌中导出针对Ａxin及上述新发觉的TNKＳ2的复合体的组份的siRNA，测定大鼠与代谢相关的表型，确定这种分子及其复合体在调控猕猴桃糖转运及脂肪细胞生成中的作用。同时,我们将构建上述基因的条件性敲除或敲入大鼠，剖析这种大鼠与糖脂代谢相关的表型,为分子及细胞水平的研究结果提供生理证据。另一方面,我们拟与上海学院附属第一诊所合作，在肥胖症、糖尿病等代谢相关疾患的患者中测量脂肪组织中TNKS2的抒发及基因突变情况,以期为代谢相关性疾患的初期分子确诊提供根据。
脂代谢稳态调控的机制研究Cide家族蛋白质（Ciｄea,Cideb和Ｆｓp2７）,ＰＴEN和AMPK在脂肪细胞和肝细胞中脂代谢稳态包括脂存放，脂分解和分泌中的作用，运用转基因和基因敲除模型在植物水平上研究脂代谢与脂肪肝发生,肝组织纤维化，增生反应,细胞异常增殖之间关系。Cidｅ家族蛋白质在脂肪细胞中脂滴产生、融合与酯化的作用及其机制我们通过Fsp２7基因敲除大鼠,大鼠胚胎纤维细胞和脂肪细胞株3T3－Ｌ1的研究表明Fsｐ27蛋白质定位于脂滴表面,可控制脂肪细胞中脂滴的产生，脂酯化,并在脂肪细胞中基因抒发调控以及胰岛素的敏感性中起重要作用。但其作用的分子机制还不清楚。我们将通过生物物理方式分离和纯化Ｆsｐ27以及脂滴,构建体外脂滴融合体系,并通过细胞影像系统活体详尽研究脂滴的动态变化过程。我们将采用酵母双杂交、免疫共沉淀的方式,寻求与Ｆsｐ２7互相作用的蛋白质,研究其与Ｆsp27互相协调调控脂滴的动态变化。同时，我们还将构建脂肪细胞特异过抒发Ｆsｐ27的转基因大鼠，研究在Ｆｓp２7过抒发后植物脂肪细胞的脂滴的大小、脂酯化的活性、脂肪细胞的分化以及胰岛素敏感性、血脂的浓度以及脂肪过量积累对肾脏和骨骼肌的脂代谢等的关系;并用脂类组学、蛋白质组学和基因组学等方式研究Fsp27调控脂肪细胞脂代谢的分子机制。
(２）CIDE蛋白质、ＰTＥN、AMPK等调控肠道细胞脂代谢的机制借助我们现有的Ｃide家族敲除大鼠和将构建的ＰＴEＮ胰脏特异敲除大鼠,我们将研究：CIDE家族蛋白质和PTEN在肠道细胞中脂肪积累、脂肪合成、脂肪酸氧化以及VLDL分泌等脂代谢的调控机制;胰脏脂代谢稳态调控与脂肪肝的发生;借助酵母双杂交、免疫共沉淀、基因组学和蛋白质组学等手段寻找在肾脏中与ＣIＤE家族蛋白质互相作用蛋白质以及受ＣIDE蛋白质调控的代谢网路。借助物理诱变剂促进肾脏细胞发生恶变。研究从脂肪肝发生后到肠道的恶变过程中糖脂代谢的变化，发炎因子的变化情况及致畸相关基因的抒发情况。测量脂肪肝发生、组织纤维化、癌变以及与发炎反应之间关系。借助原代肝细胞或肝细胞系为模型详尽研究ＣIＤＥ蛋白质、PＴEＮ和AMPＫ在肝细胞中脂肪积累、脂代谢的调控、细胞增殖和自噬的分子机制。从转基因和肥胖大鼠中分离原代肝细胞及借助实验室已有的肝细胞系，用各类因子如发炎因子、脂肪酸、细胞自噬因子等剌激，详尽研究肝细胞的脂肪积累、细胞增殖和自噬的机制,在细胞和分子水平上解释肾脏的脂肪积累和其肿瘤的关系。