一、膜蛋白简介
膜蛋白在细胞中饰演着重要的角色:比如被熟知的辨识、信号转导、运输等功能,也是服药的理想的靶向,虽植物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁杂,多数膜蛋白分子数量较少,但却赋于细胞膜十分重要的生物学功能。
按照膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合形式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因而只要改变碱液的离子硬度甚至提升体温就可以从膜上分离出来,膜结构并不被破坏。
(2)内在膜蛋白与膜结合十分紧密,通常只有用去垢剂()使其膜解后才可分离下来。
附注:使用分级抽提方式获得的“膜蛋白”中只有极少一部份是具备多跨膜区的整合膜蛋白。
二、膜蛋白的提取方式
谈及蛋白分离,我们想到:超速离心,盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这种方式往往组合到一起对特定的物质进行分离纯化。因为蛋白质种类繁杂,不同的蛋白质因为结构和组成的差别,其溶化度也各不相同.按照蛋白质的溶化特点,同时可选择不同的溶剂提取,分为水碱液提取和有机溶剂提取.
然而与胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于膜蛋白是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方式就是用不同的离心速率除去胞质蛋白等,之后用去污剂把蛋白从膜中释放下来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,通常常用的有胆络合物,CHAPS(一种离子去污剂),和等表面活性剂。
1)先分离膜,之后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法促使细胞破碎,之后通过梯度离心得到富含膜蛋白的粗组分。(比如:用液氮碾磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂,之后差速离心、蔗糖密度梯度离心。搜集37%与41%间的成份,即为质膜部份。裂解即可搜集膜蛋白)
2)用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难。在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶化出来,之后将蛋白质稳定。去垢剂的选择一般是根据他对所须要蛋白质的提取效率来确定细胞膜色谱,但在个别情况下,还要考虑到之后的纯化步骤。其实许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能须要去除去垢剂。这往往会导致蛋白质失活,但若果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题。倘若不是用于测序的细胞膜色谱,可考虑使用才能粘附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可拿来溶化膜蛋白的去垢剂.但是,她们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶化方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如X-100在280nm处有吸收,假若某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应防止使用这类去垢剂.
将膜剂型与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜剂型上将所需的膜蛋白增溶出来.这些做法的用处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成份或染色质成份的混进.使用这些方式所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数目上,都比酸溶化法所得到的蛋白(
3)膜蛋白色谱(of,CMP):CMP分离强疏水性蛋白、多肽混和物的层析系统,通常有去垢剂(如SDS)溶化膜蛋白后产生SDS-融膜蛋白,并由甲基磷灰石为固定相的木柱分离纯化。甲基磷灰石柱具有阴离子乙酸官能团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量。借助原子散射法研究cAMP的分离机制发觉,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷多肽与固定相中带电离子间的交换,进而达到分级分离的目的。
4)次序抽提法:按照细胞蛋白溶化性的差别,器具有不同溶化能力的蛋白溶化液进行抽提的方式。用Tris碱碱液裂解细胞提取高溶化性蛋白;把未溶化的沉淀用标准液溶化提取高疏水性蛋白;最后用含复合表面活性剂的蛋白溶化液,可以再度抽提前两次抽提后不能溶化的膜蛋白。
5)离心蛋白提取法()
原理:高渗的蛋白裂解液让细胞缩聚断裂后,超高速离心
评价:虽然分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,并且可溶性蛋白组分和膜蛋白组分之间依然有不少重复的点.该方式相较MP院士在1998年上发表的分级抽提法除以了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方式。
6)-based:提取时先用裂解液裂解胞膜(选用不同的去污试剂是关键),梯度离心分离细胞器(ER),之后分级抽提方式。诸如,除去细胞器以后的就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部份。
总的体会:细胞的量要很充足。以后的定性鉴别常用的技巧有单向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀丙酯凝胶电泳等。纯化蛋白质含量的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴别膜蛋白,便捷迅速。