【摘要】：缺血再灌注(／,I／R)损伤是导致移植后急性肾功能衰竭(AcuteRenal,ARF)和移植肾功能恢复延后(Graft,DGF)并最终造成移植肾短期和常年存活率增长的重要诱因之一。为此，深入揭示其作用机理将对肾移植后ARF和DGF预防有重要的理论和实际意义，是目前研究的重点和热点。已发觉钾离子通道激活是缺氧损伤的初期风波之一，也是造成肾缺血性损伤的重要诱因。喂奶植物细胞普遍存在K通道，其生理功能在不同的组织细胞中具有异质性，采用包括微电极技术，cDNA克隆和免疫组化等传统方式对植物肝脏上皮细胞(cell,TEC)进行研究，发觉TEC钾离子通道的主要作用包括：维持膜电流、K+的分泌、再循环和调节细胞容积。因为钾离子通道私密性改变是细胞缺血再灌注损伤最直接的指标，也是I／R引起细胞损害的直接证据，而对于单个TEC钾离子通道私密性改变与I／R关系的研究，目前国外外尚缺少报导。因此，本实验拟采用研究单离子通道的膜片钳技术，直接测定TEC缺血再灌注损伤后钾离子通道变化，并采用特异性钾离子通道阻断剂Ba~(2+)验证这种变化确实发生在钾离子通道；同时观察那些变化与细胞能量代谢及形态学改变之间的关系。
通过以上研究，为进一步深入了解肾缺血再灌注对TEC损伤的发生机制及其在肾移植后ARF以及DGF中的作用提供实验根据。同时，初步阐述靶点钾离子通道进行抗缺血再灌注损伤的预防策略，以及筛选特异性的钾离子通道调节剂的可行性和有效性。主要方式：1．采用传代培养人肾小管上皮细胞株，构建物理模拟缺血再灌注损伤模型。2．借助全细胞膜片钳技术检查正常培养TEC钾离子通道特点及缺氧、氧化损伤后钾离子通道改变。3．采用LDH测定试剂盒、ATP酶(Na~+、K~+和Ca~(2+)-ATP)试剂盒直接测定缺氧、氧化损伤后培养TEC能量代谢改变。4．采用免疫萤光方式测量缺氧、氧化损伤后TEC细胞骨架(微管、微丝、中间丝)改变。主要结果和推论如下：第三军医学院硕士学位论文1.缺氧、氧化损伤后TEC能量代谢改变:正常培养条件下，TEC培养基中乳酸酯化酶(LDH)的水平较低，缺氧、氧化损伤后LDH露出明显降低(P0。01)，而缺氧组和氧化损伤组之间LDH露出比较无差别(P0.05)，说明缺氧、氧化损伤可以导致细胞膜完整性的破坏，破坏程度基本一致。在钠钾一腺普三乙酸酶活力、钙一腺昔三乙酸酶活力抒发中，正常组明显低于缺氧、氧化损伤组(P0.01)，而缺氧组、氧化损伤组之间比较无明显性差别(P0.05)，进一步验证物理致伤模型模拟缺血再灌注的可靠性和有效性。
2.缺氧、氧化损伤后细胞骨架改变:TEC骨架由微丝、微管、中间丝组成，缺氧、氧化损伤后细胞骨架破坏、塌陷，网路结构和支架作用消失，说明细胞骨架的动力特点使之对缺氧和氧化损伤非常敏感，是TEC形态结构破坏、代谢与功能祸合障碍的物质基础和重要前提。3.正常培养TEC细胞钾离子通道特点:平均静息电位(RMP)为一42，56士7.35mV(n=15);串联阻抗(Rs)为11.58土2.98M。细胞膜离子通道，膜电容(Rc)为10.51士x.g8PF，翻转电位约为.40mV。对通道的开放与关掉活动的统计剖析表明，通道开放时间分布服从单指数函数，而关掉时间分布服从双指数函数方式。通道开放的两个时间常数分别为0.653ms与8.362ms，通道关掉的两个时间常数分别为1，142ms与18，924ms。这与多数不同动物种属TEC膜上钾离子通道动力学模式是一致的。4.物理缺氧、氧化损伤后住C钾离子通道改变:膜电位绝对值显著降低，缺氧、氧化损伤和正常花C膜K+电压均有电流依赖性，缺氧、氧化损伤组TEC的K+电压振幅、膜电容和K+电压密度现今小于正常飞C;与正常组TEC比较，缺氧、氧化损伤花C膜K+通道电压抒发降低。缺氧、氧化损伤几c的:值显著高于正常TEC的:值，’这说明缺氧、氧化损伤TEC钾离子通道的K+电压较正常花C达到最大电压振幅所须要时间更短，K+通道开放速率更快，活动提高，细胞内钙超员细胞膜离子通道，导致细胞毒性物质的释放，最终造成TEC的坏死和自噬。5.K+通道阻断剂B扩十对三组TEC的作用:三组花C记录到K+电压后，加入5林mo比B扩+均能使跨膜K+电压峰值显著减少，说明本实验记录到的跨膜电压为K+通道所形成的K十电压。6.通过干扰钾离子通道的变化，可能为预防缺血再灌注肾小管上皮细胞损伤提供新的方式。