萤光迸发和发射的基本原理
萤光颜料是光敏化合物，还能吸收特定波长的光能，并转化为波长更长的光。为此，萤光颜料是细胞和组织研究中常用的测量试剂。萤光颜料特有的电子构象让其具有奇特的特点性吸收波谱（常与迸发类似）和发射波谱。这种吸收和发射波谱显示了萤光的相对硬度，一般纵座标为相对硬度，横座标为波长。对于已知的萤光颜料，制造协会告知光源迸发硬度峰值的波长，以及萤光发射硬度峰值的波长。对于这种萤光颜料的迸发和发射波谱图与曲线来说，了解其来源很重要。
怎样确定萤光颜料的发射波谱
确定特定萤光颜料的发射波谱时，须要确定最大吸收波长（常等同于最大迸发波长）并在该波长下迸发该萤光颜料。图1(a)中显示了一个典型萤光颜料的吸收波谱，纵座标为吸收的相对硬度，横座标为波长。之后，我们用一个单色器（一种仅容许窄光波段通过的装置）进行扫描，得到全范围发射波长下相对应的萤光发射硬度值。图1(b)中显示了基于各波长下萤光相对硬度的检测值勾画的发射波谱。确定特定萤光颜料的迸发波谱时，也采用了类似的方式，即在用一组连续的波长迸发萤光官能团的同时，检测不同波长下的最大萤光发射硬度。确定最大萤光发射硬度，并只容许最大萤光发射硬度对应波长的发射光通过测量器。在各迸发波长下（一般通过单色器）诱导迸发，并检测作为波长函数的发射萤光硬度。检测结果可勾画为如图1(a)所示的图形或曲线，描画了全范围迸发波长波谱相对应的萤光硬度。
萤光滤光片波谱
探求萤光迸发、发射和二色滤光片波谱图的重叠区域，以及各类滤光片组合使透射特点发生变化，这些变化是怎样决定波长的带宽。
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迸发和发射波谱的观察结果
一组典型的迸发和发射曲线或波谱可让我们得到多个观察结果。迸发波谱的短波长端和发射波谱的长波长端之间一般会有一个重叠区域。在萤光显微镜中，迸发和发射硬度与波长的重叠区域（如图1(c)所示）必须通过选择适当的迸发滤光片、分光镜（反射光萤光）和发射滤光片来去除。否则，迸发光太亮会掩藏较弱的萤光发射光，因而明显减少标本的对比度。
斯托克斯定理
当电子从迸发态步入能级时，会有振动能损失（这一现象的解释见“荧光的分子机理”）。由于波长与幅射能成正比(
)，能量损失使发射波谱较相应的迸发波谱更长。这些现象被称为斯托克斯定理(’Law)或斯托克斯位移，由G.爵士在十九世纪中期发觉。斯托克斯位移越大，就越容易分离迸发光和发射光。为了获得最高的萤光硬度，最好在萤光颜料迸发波长的峰值处进行迸发，在发射波长的峰值处（或由观察者选择的其他波长下）进行测量。迸发波长和发射波长的选择由合适的滤光片控制，因而可限制准许通过的波长。在确定整个光学系统的波谱疗效时，要求进行额外的技术校准，须要考虑例如玻璃的透射率和检查器的灵敏度对应不同波长的差别等诱因。
图2显示了一个典型萤光颜料的吸收-发射波谱图。请注意，这一典型萤光颜料的吸收（常与纯化合物的迸发曲线相像）和发射萤光硬度曲线在形状上有些相像。据悉，在迸发曲线的短波长端和发射曲线的长波长端有部份重叠。
萤光滤光片组
探求迸发和吸收滤光片的带通波长区域的改变是怎样仅让特定的波段照射样本，并随即通过测量器，同时排除其他波长。
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迸发和发射波长的分离
迸发和发射波长的分离可通过选择适当的滤光片制止或放行波谱中的特定波长而实现，如图3所示。萤光照陶俑的设计是基于对迸发光和发射光的控制，即在通向样本的（迸发）光路和样本所形成的（发射）光路中插入可随时更换的滤光片。考虑到发射硬度低的情况，选择的迸发光源必须有足够的照度，这样就能最大限度地测量到相对较弱的发射光，同时选择的萤光颜料须要具备合适的吸收和发射效率。
萤光颜料吸收迸发光的效率称为分子消光系数。分子消光系数越大，给定波长范围内光吸收的可能性就越大（诱发萤光发射的前提条件之一）。发射光的丰度称为量子丰度，即发射的量子数（能量“包”）与吸收的量子数之比（许多商用萤光颜料的丰度在0.1和0.9之间）。量子丰度高于1是能量通过非幅射路径（如热或则光物理反应），而不是通过萤光的再幅射路径损失能量的结果。表1中给出了一组特定萤光颜料的萤光量子丰度。请注意，有些萤光颜料的量子丰度虽然很低（苯），而其他则很高（萤光素和罗丹明-B）。
萤光颜料的萤光量子丰度表1化合物溶剂迸发
波长
(nm)发射
波长
(nm)量子丰度
吖啶橙
乙酸
493
535
0.46
苯
乙酸
248
300-350
0.04
叶绿素A
乙酸
440
685
0.23
伊红
水
521
544
0.16
萤光素
水
437
515
0.92
罗丹明-B
乙酸
555
627
0.97
光源的分子消光系数、量子丰度和平均发光硬度（固有照度）以及萤光寿命（迸发态的持续时间）都是影响萤光发射硬度和可用性的重要诱因。据悉，萤光颜料周围的局部环境是决定萤光发射特点的关键诱因。环境中的溶剂黏度、离子含量、pH值和疏水性等变量，对萤光硬度和迸发态的寿命都有着重要影响。
萤光的分子机理
另一种勾勒萤光活性的方式是雅布隆斯基()图叶绿素荧光现象的原理，如图4(a)所示。迸发前，分子的电子构象一般处于能级下。吸收了迸发光的一个光子后叶绿素荧光现象的原理，电子可能在短短的几皮秒（10-15秒）内获得更高的能量跃迁到震动迸发态。
在大概万亿分之1秒（飞秒或10-12秒）内，迸发态电子可能会向周围环境中释放部份振动能，并返回到最低迸发单重态。随即，电子可从最低迸发单重态“弛豫”回到能级，同时发射萤光，如图4(a)所示。发射光的波长仍然比迸发光波长长（斯托克斯定理），但是只要迸发光仍然照射萤光标本，发射光都会持续存在。假如迸发光停止，发射萤光也会消失。
雅布隆斯基能量图
借助雅布隆斯基基态图探求电子是怎样吸收能量并跃迁到更高的能量状态。电子处于迸发态时，都会在震动效应下平缓弛豫，之后通过发射光子（萤光）后回到能级。
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有时，迸发后的电子不会在震动效应下弛豫到最低的单重态，而是向迸发三重态进行跃迁，之后再回到能级，在这个过程中，幅射的发射现象可显著延后几秒或更多时间。这一现象是磷光的特点，如图4(b)所示。在个别情况下，迸发后的电子可能会从三重态回到最低的迸发单重态，之后再回到能级，此后发射萤光。这一作用的时间比一般的萤光略长（约一两毫秒），称为延后萤光（图4(c)）。在光漂白或存在重金属盐或其他物理物质等其他情况下，发射光可显著减少甚至完全消失。
退色或光漂白
有些特定条件可影响受迸发的萤光官能团的再幅射，进而造成萤光硬度增长。这些减少发射光硬度的现象一般称为退色或光漂白。有时会将退色进一步细分为淬灭和漂白。漂白是萤光分子在分子氧存在下因为光强而发生的不可逆分解。淬灭也会造成萤光硬度增加，且常由氧化剂的作用或存在重金属盐或卤素化合物而引起。
一般，淬灭是因为能量从迸发态萤光络合物转移到数学上接近的其他受体分子而产生的，亦称为共振能量转移。这些特殊的现象早已成为一种更新技术的基础，这些技术用于检测远高于光学显微镜纵向码率的距离。
漂白的发生造成了FRAP技术的产生，即萤光漂白后恢复技术。FRAP技术借助短脉冲激光漂白，因而可观察随即因萤光官能团扩散到漂白区域中而导致的萤光恢复现象。
常用抗淬灭试剂的特点表2防退色剂注释
对苯二胺
对FITC最有效试剂。也对罗丹明有效。使用甘油/PBS进行配制，含量为0.1%。此试剂在光照下会变黑，应储存于暗处。接触皮肤时非常危险。
三乙烯二胺
（1,4-二氮杂三环-2,2,2-辛烷）
对FITC高度有效。与对苯二胺相比，疗效略低，但其更耐水，且安全水平更高。
没食子酸正丁醇
对罗丹明和FITC都有疗效。使用甘油/PBS进行配制，含量为0.1%。
2-甲基吗啉
用于观察碘化丙啶、吖啶橙或色霉素A3染色的染色体和DNA样本。应在Tris-EDTA中调节至0.1mM2-甲基吗啉的纯度。
为了增加部份样本的退色程度，建议在光抵达迸发滤光片之前的光路中使用一个中性灰度滤光片，可以减少迸发光的硬度。在其他情况下，可改变封丸剂的pH值或使用抗漂白剂（表2中列举了几种较为重要的试剂）可减少退色效应。在数字成像、显微成像或简单目视观察时，快速改变观察视野也可防止掉色效应。