你们好，明天给你们介绍一篇上的文章，标题是“Afor–oncell”，通信作者是加洲学院戴维斯校区的B.。院士的主要研究方向是糖质谱组学。本文介绍了一种抗体抗原毗邻标记(AAPL)方式，该方式可以勾画抗体互相作用位点以及抗原靶蛋白的互相作用位点。作为一种概念的证明，AAPL被证明使用钠/钾转运ATP酶()和表皮生长因子受体2(ERBB2)特异性抗原，用Fe(III)催化探针修饰。一旦与目标蛋白结合，Fe(III)诱导的催化氧化发生在抗体表位附近。之后使用氧化蛋白质组学剖析来确定氧化程度，氧化位点在目标抗体，以及紧靠目标抗体的互作蛋白。对每位蛋白质进行AAPL评分，得出氧化的特异性和互作蛋白质与目标抗体的相关程度。为了验证其疗效，AAPL方式被用于勾画结肠炎细胞中钙黏附素(LI-,CDH17)的互作网路。
细胞膜蛋白互相作用在讯号转导和其他基本的生物学途径中是必不可少的。基于质谱的方式，如亲和纯化质谱（AL-MS）和交联质谱（XL-MS）近些年来常被用作蛋白-蛋白互相作用的表征。借助过抒发表位标记的诱饵蛋白（Bait），可以实现AL-MS的富集过程，从而进行MS鉴别，但是弱互相作用难以通过AL-MS来捕捉。XL-MS通过光或物理交联过程使交联探针与靶蛋白产生共价联接，能同时捕捉强或弱互相作用。
基于质谱的毗邻标记结合蛋白质组学技术是另一种广泛用于侦测蛋白质互相作用的方式。通过将目标蛋白与特定的酶或催化探针融合，将定位在互相作用位点附近的蛋白通过催化反应进行标记，之后用定量蛋白质组学进行表征。借助毗邻标记蛋白质组学，可以辨识出与目标物具有强或弱相互作用的蛋白。作者开发了抗体抗原毗邻标记(AAPL)技术，通过紧邻依赖氧化来勾画抗体的表位以及抗体的互作网路。作者提出了2种修饰方式即和FeAb，其中通过β-半乳香豆素酶酯化抗原末端半乳香豆素键，再借助UDP-与GalT-Y289L使抗原带上叠氮基，在与DBCO-分子发生SPAAC反应后，抗原最终带有Fe(III)。FeAb即直接通过Br-对抗原上半胱谷氨酸羧基发生卤素加成，最终分子联接到抗原。（1）
1和FeAb的制备流程
作者使用辨识Na+/K+ATP酶或则表皮生长因子受体2的抗原作为概念验证。通过定量的氧化蛋白质组学剖析来检测目标抗体及其相关蛋白的氧化，以优化特异性标记的反应条件。（2）
2APPL方式标记的原理
糖组学剖析表明，和FeAb中含叠氮官能团的聚糖约占所有类型聚糖的50%，免疫萤光成像证明修饰前后抗原的靶点结合能力不变。同时为了避免二溴化和非特异性氧化反应，作者进行了一系列的条件优化，通过被氧化肽段的硬度估算每位蛋白结合位点的氧化程度，用EPO（of）值代表，最终发觉在不同的细胞系和抗原修饰方法等条件下须要使用的氧化条件并不完全相同。
AAPL-MS的打分方法参考了AP-MS中的谱图计数法，使用拓扑学分数（TopS）作为AAPL打分结果。该分数>0则觉得氧化位点相对于对照组更有特异性。作者也提及对于不同的蛋白，虽然AAPL分数在同一范围，其氧化位点数也并不完全一致。
为了验证AAPL打分的确切性，作者将和ERBB2互作分子的分类结果与数据库进行比较，则是按照导入文献数据提供基于蛋白质之间互相作用程度的得分。在数据库中，作者将具有高置信区间（分数>0.7）和中置信区间（分数0.4~0.7）的蛋白分别归为T1和T2，二级互相作用，即与T1,T2有互作但并不直接和或ERBB2有互作的蛋白归为T3，其余的氧化蛋白定义为T4。作者将T1，T2的AAPL打分进行对比，发觉相对于其它蛋白确实具有更高的分数。T1和T2的EPO差别倍数也被探究，T1和T2所有互作蛋白的AAPL打分均>0，对于EPO差别倍数在1.5~5细胞膜蛋白，而对于ERBB2的EPO差别倍数在1.5~3。这证明AAPL打分与基于数据库的打分结果一致。（3）
3借助和APPL对和ERBB2抗原的互作蛋白进行剖析
为了验证基于AAPL鉴别和ERBB2抗原的互作蛋白是否和和ERBB2相关，作者进行了GO剖析。对于互作蛋白，GO剖析表明，多个基因属于参与跨膜转运蛋白活性和宽孔通道活性的蛋白组，这种蛋白组与的功能相关。而ERBB2和4个功能有关，分别是裂合酶，多肽转移酶，载脂蛋白结合和大分子跨膜转运体活性。
4借助GO对和ERBB2抗原的互作蛋白功能进行注释
作者将APPL在CDH17中进行验证，该蛋白在肝和小肠都高抒发，此前有文献报导CDH17介导的细胞集聚与细胞质互作无关。作者使用了Caco-2细胞系，未分化的Caco-2是结结肠肿瘤细胞系，分化后具有小肠上皮细胞的特点。有趣的是，在未分化的Caco-2细胞系中，很难通过CDH17使用AAPL找到氧化蛋白，而在分化细胞系中则很容易找到细胞膜蛋白，作者觉得这是因为CDH17本身抒发量高低造成能结合的修饰抗原数不同，但这也从侧面反映了AAPL的特异性。在中被预测为T1的蛋白，在AAPL中并不属于L1或L2，这与之前报导的CDH17介导的细胞集聚过程相对独立于其它钙黏蛋白的报导一致。在T2中，PTPN1和VTNC在AAPL中被同时鉴别下来，有文献报导两者被觉得和E-钙黏蛋白互作网路相关。T3和T4也被研究（Fig5A），并进行GO剖析（Fig5B），并发觉其中一些蛋白具有整合素结合功能。
5A.借助和APPL对CDH17的互作蛋白进行预测剖析B.使用GO剖析注释CDH17互作蛋白的功能
作者进一步探究了CDH17糖基化与互作网路的关系。往年的糖蛋白组学剖析发觉Caco-2分化细胞系的CDH17糖基化程度相对于未分化系更高。CDH17的糖基化修饰70%都是唾液酸化的岩藻糖，岩藻糖化的糖肽占到了19%，富含3%的高甘露糖型糖肽，和少部份的中性糖肽。而未分化的Caco-2细胞系具有更高比列的高甘露糖型糖肽和更少的唾液岩藻糖化糖肽。
作者分别使用了α-甘露鞣质酶抑制剂几夫碱（Kif）和唾液酸转移酶抑制剂3Fax-，并发觉Kif使CEAM1,ATLA3,1A02,andVTNC的EPO值升高，提示这种蛋白与CDH17的互作增加，但STT3A和NOMO2的EPO并不升高。使用ST抑制剂时，也有类似的变化，即前几种蛋白EPO值均下降。通过糖蛋白组学剖析发觉前4种蛋白本底为高唾液酸化修饰，而后2种蛋白本底为高甘露糖型修饰，这解释了糖基化抑制剂处理造成的EPO程度不同的缘由，同时也表明CDH17的糖基化水平对其蛋白互作有较大影响。
其实，作者提出了一种Fe(III)修饰抗原用于研究细胞表面蛋白-蛋白互相作用的方式，通过与其它数据库及打分方法的对比验证了技巧特异性，并以CDH17作为验证，探究糖基化水平在蛋白互作中发挥的作用。