对于干式物镜，介质为空气，透镜开口比一般为0.05~0.95； 油镜片以雪松油为介质，镜片开口率可接近1.5。 普通光的波长为400~700nm，因此显微镜的分辨率值不会低于0.2μm。 人眼的分辨率为0.2mm，因此一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 （2）荧光显微镜 图2-2 Nikon E800荧光DIC显微镜 细胞内的某些物质，如叶绿素，受到紫外线照射后会发出荧光； 其他物质本身不能发出荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，在紫外线照射下也能发出荧光。 荧光显微镜（图2-2、3、4）是对该类物质进行定性和定量研究的工具之一。 图 2-3 落射照明原理 荧光显微镜与普通显微镜有以下区别： 1、照明方式通常为落射照明，即光源通过物镜投射到样品上（图 2-3 ）； 2、光源为紫外光，波长比普通显微镜更短，分辨率更高； 3、有两片特殊滤光片，光源前面的一片用于滤除可见光，目镜与物镜之间的一片用于滤除紫外线，保护人眼。 图2-4 荧光显微镜照片（微管为绿色，微丝为红色，细胞核为蓝色），图片来自（3），激光共焦扫描显微镜 图2-5 激光共焦扫描显微镜 图2-6 LCSM照片，蓝色是细胞核，绿色是微管。 图片来自激光共焦扫描显微镜（图2-5、6）。 采用激光作为扫描光源，逐点、逐线、逐面快速扫描成像。 收集扫描激光和荧光。 共用一个物镜，物镜的焦点是扫描激光的焦点，也是瞬间成像的物点。
由于激光束的波长较短且光束很细，因此共焦激光扫描显微镜具有较高的分辨率，约为普通光学显微镜的三倍。 系统聚焦一次后，扫描仅限于样品的一个平面。 当聚焦深度不同时，可以获得样品不同深度级别的图像。 这些图像信息存储在计算机中。 通过计算机分析和模拟，可以显示细胞样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜不仅可用于观察细胞形态，还可用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计、细胞形态测量等。 (4)暗视野显微镜：暗视野显微镜的聚光镜中心有一块光板(图2-7)，使照明光不直接进入人的晶状体，只有反射的光被标本衍射的光被允许进入物镜，因此视场的背景是黑色的，物体的边缘是明亮的。 使用这种显微镜，可以看到小至4至200nm的颗粒，分辨率可比普通显微镜高50倍。 图2-7 暗视场照明法（5）、相差显微镜 相差显微镜（ope，图2-8、9）是由P.设计的，于1932年发明，并因此获得1953年诺贝尔物理学奖。 这种显微镜的最大特点是可以观察未染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是将可见光透过标本的光程差转化为振幅差，从而提高各种结构之间的对比度，使各种结构清晰可见。
光线穿过标本后发生折射，偏离原来的光路，并被延迟1/4λ（波长）。 如果增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光束合并后发生干涉。 加强、增加或减少振幅、增加对比度。 从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜有两个特殊之处： 1、环形光阑（？）位于光源和聚光镜之间，其作用是与光线形成一个空心光锥。通过冷凝器。 专注于样本。 2、相位板（） 在物镜上添加了涂有氟化镁的相位板，可以使直射光或衍射光的相位延迟1/4λ。 它分为两种：(1)． A+相位板：直射光延迟1/4λ。 两组光波结合后，光波相加，振幅增大。 标本结构变得比周围介质更亮，形成明亮对比度（或称为负对比度）。 (2).B+相位板：使衍射光延迟1/4λ。 两组光线组合后，光波相减，振幅变小，形成暗对比（或正对比），结构变得比周围介质更暗。 图2-8 相差显微镜的照明原理 图2-9 介壳虫的染色体（PCM照片） （6）、偏光显微镜 偏光显微镜（）用于检测双折射物质，如纤维、纺锤体、胶原蛋白、染色体等。与普通显微镜的区别在于光源前面有一个偏光板（偏光镜），使进入显微镜的光为偏振光，并且有一个分析器（带有偏振光的偏光镜）方向垂直于偏光镜）在镜筒中。 这种显微镜的载物台可以旋转。 当单个折射物质放置在载物台上时，无论载物台如何旋转，由于两个偏光镜是垂直的，因此在显微镜中看不到光。 当引入双折射材料时，通过旋转平台来检测物体，因为光在穿过材料时会发生偏转。
（7）微分干涉相差显微镜 1952年，根据相差显微镜的原理发明了微分干涉相差显微镜（PE）。 DIC显微镜也称为相差显微镜（示波器）。 其优点是可以显示结构的三维投影图像。 与相差显微镜相比，标本可以稍厚一些偏光显微镜可以根据细胞微细结构的不同，折射率差异更大，因此图像具有更强的三维效果。 DIC显微镜的物理原理与相差显微镜完全不同，技术设计也复杂得多。 DIC使用偏振光，有四个特殊的光学元件：起偏器（）、DIC棱镜、DIC滑翔机和检偏器（）。 起偏器直接安装在聚光系统前面，使光线发生线偏振。 聚光镜中安装有石英棱镜（DIC 棱镜）。 这种棱镜可以将一束光分解成两束偏振方向不同的光（x和y），并且两者形成一个小角度。 聚光镜使两束光束平行于显微镜的光轴。 最初，两束光具有相同的相位。 在穿过试样的相邻区域后，由于试样的厚度和折射率不同，两束光之间会产生光程差。 第二个棱镜，即 DIC 滑翔机，安装在物镜的后焦平面上，它将两个光波合二为一。
此时，两束光的偏振面（x和y）仍然存在。 最后，光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。 在光束在目镜中形成 DIC 图像之前，检偏器与偏振器成直角。 分析器将两个垂直的光波组合成具有相同偏振平面的两束光束，使它们发生干涉。 x 波和 y 波之间的光程差决定了传输的光量。 当光程差为0时，没有光通过检偏器； 当光程差等于波长的一半时，通过的光达到最大值。 所以在灰色背景下，标本结构呈现出明暗差异。 为了达到图像的最佳对比度，可以通过调节DIC滑块的纵向微调来改变光程差。 光程差可以改变图像的亮度。 调整DIC滑块可以使标本的精细结构呈现出正投影或负投影图像，通常是一侧亮，另一侧暗，从而产生标本的人造三维感，类似于大理石上的浮雕（图2 -10）。 DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如细胞核、线粒体等，具有特别强的三维感，使其适合显微操作。 目前基因注射、核移植、转基因等显微操作常在此显微镜下进行。 图 2-10 DIC 显微镜下的硅藻（伪彩色）（8）。 倒置显微镜的组成与普通显微镜相同，只是物镜和照明系统相反。 前者在载物台下，后者在载物台上方（图2-11），用于观察培养的活细胞，配有相差物镜。 图2-11 徕卡倒置显微镜 自20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和生产取得了长足的进步。 发展趋势主要体现在注重实用性和多功能性的提高。
装配设计倾向于采用组合方式，将普通光学显微镜加上相衬、荧光、暗视野、DIC、摄影装置集成在一起，操作灵活、易于使用。 2. 电子显微镜 (1)、透射电子显微镜 1. 基本原理 小于 0.2 μm 的精细结构在光学显微镜下无法清晰可见。 这些结构称为亚显微结构 (ures) 或超显微结构 (;)。 为了清楚地看到这些结构，必须选择波长较短的光源以提高显微镜的分辨率。 1932年，Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（TEM）。 电子束的波长比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射的电子束的电压的平方根成反比，也就是说，电压越高，波长越短。 目前TEM的分辨率可以达到0.2nm。 电子显微镜（图2-12）和光学显微镜的成像原理基本相同。 不同的是前者使用电子束作为光源，电磁场作为透镜。 另外，由于电子束的穿透力很弱，用于电子显微镜的标本必须制成厚度约为50 nm的超薄切片。 这种切片需要用超薄切片机（）来制作。 电子显微镜的放大倍数高达近百万倍，由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统五部分组成。
表2-2 不同光源的波长名称分别称为可见光、紫外光、、 样品制备技术 1) 超薄切片通常用锇酸和戊二醛固定样品，包埋在环氧树脂中，通过热力推进样品切片。扩张或螺旋推进（图2-13）。 切片厚度20~50nm。 切片用重金属盐染色以增加对比度（图 2-14）。 图2-13 徕卡超薄切片机 图2-14 内质网透射电镜图像（伪彩色） 2）负染技术 负染是利用重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀酰）铺在载体网上进行染色样本; 吸收染料，样品干燥后，样品凹下区域铺有一层薄薄的重金属盐，而凸出区域没有染料沉积，产生负染色效果（图2-15） ），分辨率高达约1.5nm。 图2-15 肌动蛋白纤维负染电镜照片 3) 冷冻蚀刻 冷冻蚀刻(-)也称为冷冻断裂(-)。 将标本置于-100℃干冰或-196℃液氮中冷冻。 然后用冷刀突然切断标本。 温度升高后，冰在真空条件下迅速升华，露出断面结构，这称为蚀刻（）。 蚀刻后，在45度角的截面上喷涂一层蒸气铂偏光显微镜可以根据细胞微细结构的不同，然后在90度角的截面上喷涂一层碳，以增强对比度和强度。
然后用次氯酸钠溶液消解样品，剥离碳和铂膜。 这种薄膜称为复合薄膜（）。 涂层显示了试样蚀刻表面的形状，在电子显微镜下获得的图像代表了试样中细胞断裂表面的结构（图2-16）。 图2-16 冷冻蚀刻电子显微镜照片（2）、扫描电子显微镜 图2-扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（SEM，图2-17、18、19）出现于20世纪60年代，用于观察表面标本结构。 其工作原理是利用极细的电子束扫描样品，在样品表面激发二次电子。 二次电子的数量与电子束的入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关。 形成二次电子，由探测器收集信号并通过闪烁体将其转换为光信号，然后通过光电倍增管和放大器将其转换为电信号，以控制电子束在荧光屏上的强度并显示与电子束同步的扫描图像。 该图像是三维图像，反映了标本的表面结构。 为了使标本表面发射二次电子，在标本固定脱水后，喷涂一层重金属颗粒。 重金属在电子束的轰击下发出二次电子信号。 目前扫描电子显微镜的分辨率为6~10nm。 人眼可以分辨荧光屏上相距0.2mm的两个光点。 扫描电子显微镜的最大有效放大倍数为0.2mm/10nm=。 图2-18 光学显微镜、TEM、SEM 成像原理对比 图2-19 人体血细胞SEM 照片 图片来自III. 扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜（STM）是由等人发明的。 1981年。它是基于量子力学原理中的隧道效应。 设计。
当原子级尖端在小于一纳米的高度扫描样品时，电子云在此重叠并施加电压（2mV~2V）。 尖端和样品之间发生隧道效应，电子逸出，形成隧道电流。 电流强度和尖端与样品之间的距离之间存在函数关系。 当探头沿给定高度的材料表面扫描时，由于样品表面原子不均匀，探头与材料表面的距离不断变化，导致电流不断变化。 变化发生了。 可视化电流的这种变化揭示了原子水平上的凹凸不平的模式。 扫描隧道显微镜的分辨率非常高，横向可达0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。 其优点是可以观察所有三态（固态、液态、气态）物质，而普通电子显微镜只能观察制备好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的原子排列，以及生物膜、细胞壁等某些生物结构的原子排列。 4.显微操作技术 图2-20 尼康NT-88NE显微操作器/注射器（图片来自） 显微操作技术（）是指在高倍复合显微镜下使用显微操作器（，图2-20）操作细胞或细胞的方法早期胚胎。 显微操作器是一种用于控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括核移植、显微注射、嵌合技术、胚胎移植和显微解剖。 核转移技术已经存在了几十年。 (1962) 成功地在非洲爪蟾中进行了核移植。 我国著名学者佟第舟等人在鱼细胞核移植方面做了大量工作，取得了丰硕成果。
