#仪器博物馆#是仪器信息网微信公众号与仪器导购联合打造的仪器科普专栏。 它每周都会推荐一种乐器。 本周是第36期。 （文末列出常见品牌）本期仪器博物馆，我们来聊聊激光共焦显微镜的“一切”。
“共焦显微镜”又称“激光共焦显微镜”、“激光扫描共焦荧光显微镜”，是利用计算机、激光和图像处理技术获取生物样本三维数据的最先进的分子和细胞生物学方法。 分析仪器。 主要用于观察活细胞的结构和特定分子、离子的生物变化、定量分析、实时定量测定。
今天小普就来探讨一下它的发展历史、结构原理、分类应用等，用一篇文章对共焦显微镜进行彻底的介绍。
注：您还希望我们为哪些类型的乐器建立“乐器博物馆”？ 请给小朴君留言。
01“共焦显微镜”的历史
1957年，他提出了共焦显微镜技术的一些基本原理，并研制出了最早的共焦扫描显微镜原型，并在美国获得专利。
但当时缺乏合适的超强光源偏光显微镜法观察聚合物球晶形态，数据处理能力达不到要求的标准。 这个想法实际上只停留在理论阶段。
有趣的是，共焦技术远非我们何先生最伟大的成就，他更被称为“人工智能之父”，他发明了世界上第一个神经网络模拟器Snare、世界上第一个可以模拟人类活动的机器人Robot C、以及“虚拟现实”（VR）的倡导者。 。
马文·明斯基 ( )
明斯基开发的共焦扫描显微镜原型
1967 年，Egger 和同事成功地使用共焦显微镜制作了光学横截面。
1977年，首次描述了光与被照射物体原子之间的非线性关系以及激光扫描仪的拉曼光谱。
1978年，德国兄弟 （）和 （）首先提出了共焦激光扫描显微镜（Laser，简称CLSM）的设计：基于荧光显微成像，配备激光扫描装置，激光聚焦逐点扫描法与荧光标记生物样品的三维检测方法相结合，通过计算机处理（类似于扫描电子显微镜）重建三维图像。
左： ( ) 右： ( )
1984年，该公司推出了世界上第一台商业化的共焦显微镜，型号为SOM-100，采用步进式扫描方式。
1986 年，MRC-500 改进为光束扫描，并用作生物荧光显微镜的共焦系统。
1987年，White和Amos在英国《自然》杂志上发表了《共焦显微镜时代的来临》一文，标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。
02“共焦显微镜”的结构及原理共焦显微镜的结构
激光扫描共焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机和图像输出装置。
1. 扫描模块
扫描模块主要由针孔光阑（控制光学片厚度）、分光镜（根据波长改变光传播方向）、荧光发射分色器（选择一定波长范围内的光进行检测）、探测器（光电倍增管）组成。 荧光样品中的混合荧光进入扫描仪，经过检测针孔光阑、分光镜和分色器的选择后，分为单色荧光，在不同的荧光通道中进行检测，形成相应的共焦图像。 同时，计算机屏幕上可以显示多个并排的单色荧光图像及其合成图像。
2. 荧光显微镜系统
显微镜是LSCM的主要组成部分，关系到系统的成像质量。 显微镜光路采用无限远光学系统，可以轻松插入光学选件，而不影响成像质量和测量精度。 物镜应采用大数值孔径平复消色差物镜，有利于荧光的采集和清晰的成像。 物镜组的转换、滤色片组的选择、载物台的移动和调节、焦平面的记忆锁定等均应由计算机自动控制。
激光扫描共焦显微镜中使用的荧光显微镜与常规荧光显微镜大体相同，但它有自己的特点：需要连接扫描仪，使激光进入显微镜物镜照射样品并允许样品发出的荧光到达检测器； 需要一个光路转换装置，即汞灯和激光转换，而汞灯的光强是可调的。
3.常用激光器
激光扫描共焦显微镜使用的激光光源包括单激光和多激光系统。 常用的激光器包括以下三种类型：
半导体激光器：405nm（近紫外谱线）
氩离子激光：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光）
氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器）633nm（红光-氦氖红激光器）
UV激光（紫外激光）：351nm、364nm（紫外光）
4、辅助设备
风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光扫描共焦显微镜的基本工作原理是激光器首先发出一定波长的激发光。 光经过放大后，通过扫描仪内的照明针孔光阑，形成点光源。 物镜聚焦在样品的焦平面上。 相应照射点发出的荧光被激发，穿过检测孔孔径，到达检测器，并在计算机显示器屏幕上成像。 这样，焦平面上样品各点的荧光图像就形成了完整的共焦图像，称为光切面。
激光扫描共焦荧光显微镜相对于普通荧光显微镜的优势
（1）LSCM图像以电信号的形式记录，因此可以采用各种模拟和数字电子技术进行图像处理；
（2）LSCM利用共焦系统，有效消除焦点外光信号的干扰，提高分辨率，显着提高视场的宽度和深度，使无损伤光学切片成为可能，实现三维空间定位；
（3）由于LSCM可以随时采集并记录检测信号，为生命科学观察活细胞结构和特定分子、离子的生物变化开辟了新途径；
（4）LSCM除了成像功能外，还具有图像处理功能和细胞生物学功能。 前者包括光学切片、三维图像重建、细胞物理和生物测量、荧光定量、定位分析和离子的实时定量测定。 ; 后者包括贴壁细胞的分选、激光细胞纤维手术和光阱技术、荧光漂白后的恢复技术等。
共焦显微镜的成像原理
点光源用于照亮样本，在焦平面上形成一个小而清晰的光斑。 光斑被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原来的照射光路返回到由二向色镜组成的分束器。 光谱仪将荧光直接发送至检测器。 光源和检测器前面各有一个针孔，分别称为照明针孔和检测针孔。 两者的几何尺寸一致，约为100-200nm； 相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点经过一系列透镜，最终可以同时聚焦在照明针孔和检测针孔上。 这样，来自焦平面的光线可以集中在检测孔的范围内，而来自焦平面上方或下方的散射光被阻挡在检测孔之外，无法成像。 用激光逐点扫描样品，检测针孔后面的光电倍增管也逐点获得对应光点的共焦图像，转换成数字信号传输到计算机，最后聚合在屏幕变成整个焦平面的清晰共焦图像。 。
每个焦平面图像实际上是样本的光学横截面。 该光学截面总是具有一定的厚度，也称为光学薄片。 由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，且非焦平面光被针孔过滤，因此共焦系统的景深近似为零。 沿Z轴方向扫描可以实现光学断层扫描，在样品的聚焦光斑处形成所需观察的二维光学断面。 将XY平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累积连续水平的二维图像并用专门的计算机软件进行处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦在同一点，使得焦平面外激发的荧光无法进入检测针孔。
激光共焦的工作原理简单的表达就是它采用激光作为光源。 在传统荧光显微镜成像的基础上，增加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，系统由计算机控制，对数字图像进行采集和处理。
03“共焦显微镜”的分类
目前，根据共焦点相对于标本的移动方式，共焦显微镜可分为三种类型。
最简单的一种是在透镜系统的光轴上固定一个发射极限点，控制其不发生，同时移动标本（标本扫描）（等，1989）；
另一种是多点扫描式。 弧光灯发出的光沿着旋转孔板精确定位，并并行扫描和检测（Egger and，1967；Xiao and Kino，1987），这是旋转盘共焦显微镜（spin disk）；
最常见的类型是单点扫描，其中通过移动镜子或使用声光偏转计使激光通过光栅偏转（等人，1985）。
04“共焦显微镜”的应用领域
激光共聚焦成像系统可用于观察各种染色、未染色和荧光标记的组织和细胞，观察和研究组织切片和活细胞的生长发育特征，研究和测量细胞内的物质运输和能量转换。 能够进行活细胞内离子和pH值变化（RATIO）的研究、神经递质研究、微分干扰和荧光断层扫描、多重荧光断层扫描和叠加、荧光光谱分析、各种荧光指标的定量分析以及时间延迟荧光样品组织、细胞三维动态结构成分扫描及动态成分、荧光共振能量转移分析、荧光原位杂交研究（FISH）、细胞骨架研究、基因定位研究、原位实时PCR产物分析、荧光漂白恢复研究（FRAP）、细胞间通讯研究、蛋白质间通讯研究、膜电位和膜流动性研究等，完成图像分析和三维重建等分析。
激光共聚焦显微镜系统的应用领域包括医学、动植物科学研究、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传学、药理学、生理学、光学、病理学、植物学、神经科学、海洋生物学、材料科学、电子科学、力学、石油地质学、矿物学。
在生物学领域的应用
细胞形态分析（细胞或组织内部微观结构的观察，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）； 荧光原位杂交研究； 基因定位研究和三维重建分析。
1、细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构及分布变化；
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析； 3.药理学：药物对细胞的影响及其动态； 4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态； 5、神经生物学：神经细胞结构、神经递质成分、运输与传递、递质受体、离子流入与流入、神经组织结构、细胞分布； 6.微生物学和寄生虫学：细菌和寄生虫的形态结构； 7、病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等； 8.遗传学与组织胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞三维结构、染色体分析、基因表达、遗传诊断。
医疗领域的应用
A. 在神经科学中的应用
1、荧光定量测量； 2.细胞内离子的测定； 3.神经细胞形态观察。
B.在耳鼻喉科中的应用
1.在内耳毛细胞亚细胞结构研究中的应用；
2.激光扫描共焦显微镜荧光钙测量技术在内耳毛细胞研究中的应用；
3.激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究中的应用；
4.激光扫描共焦显微镜在嗅觉研究中的应用。
C.在肿瘤研究中的应用
1. 免疫荧光定量分析；
2. 细胞内离子分析；
3.图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析；
4.三维重建。
D. 激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用
1.细胞内钙离子的测定；
2. 免疫荧光定位和免疫细胞化学研究；
3.细胞形态研究：采用激光扫描共聚焦显微镜。
E.在血液疾病研究中的应用
1.在血细胞形态和功能研究中的应用；
2.在细胞凋亡研究中的应用。
F. 在眼科研究中的应用
1.利用激光扫描共焦显微镜观察组织和细胞结构；
2、利用特殊荧光染色观察体内角膜创伤修复过程中的细胞迁移和成纤维细胞的出现；
3、利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜视神经细胞的分布和神经元的树突形态；
4.三维重建。
G. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏疾病中的应用
它可以系统地观察正常人肾小球系膜细胞的断层图像和三维成像水平，使图像更加清晰。 计算机分析系统可以分析一切，从外观到内部结构，从平面到三维，从静态到动态，从形态到功能的几个方面对系膜细胞的理解都有了提高。
MEMS领域的应用
微米和亚微米元件的尺寸测量、各种工艺（显影、蚀刻、金属化、CVD、PVD、CMP等）后的表面形貌观察和缺陷分析。
半导体/LCD领域的应用
各种工艺（显影、蚀刻、金属化、CVD、PVD、CMP等）后的表面形貌观察、缺陷分析、线宽、台阶深度等非接触测量。
在精密机械部件和电子设备领域的应用
微米和亚微米部件的尺寸测量、各种表面处理工艺、焊接工艺后的表面形貌观察、缺陷分析、颗粒分析。
在摩擦学、腐蚀和其他表面工程领域的应用
磨痕体积测量、粗糙度测量、表面形貌、腐蚀和亚微米表面工程后的表面形貌。
在材料科学中的应用
新材料研发、缺陷分析、失效分析。
05 关于“共焦显微镜”的常见问题 1. 扫描的最终图像不清晰。
出现此类问题的主要原因有两个：
1.物镜和ZOOM值选择不正确。
大多数初学者用户更喜欢使用10X物镜，然后将ZOOM值调整到所需的最大值。 增加ZOOM值确实可以放大图像，有助于清晰地看到图像的细节，但ZOOM的增加是有限的，具体取决于物镜的放大倍数。 例如，在10X物镜下，ZOOM值超过10是没有意义的，ZOOM值的增加属于电子放大。 放大倍数越高，清晰度越差。 因此，当观察的样品尺寸较小时，常采用高倍物镜（如63X水镜或油镜），并适当调整ZOOM值。 ZOOM 值不应超过 2。
2. 错误地将Z轴旋转球的功能等同于显微镜焦点微调旋转器的功能。
在准确调焦的基础上，通过左右调节Z轴旋转球，可以观察到目标样本图像因Z轴距离变化而引起的图像清晰度变化。 感觉就像通过调整焦距使图像更清晰一样。 因此，很多用户直接使用旋转球来调整图像清晰度，而没有准确调整焦距，导致图像模糊。
2、扫描背景较强，图像质量较差
解决这一问题的关键是根据样品的制备质量选择合适的针孔尺寸，并将激光管电压、光电倍增管功率、信噪比等参数调整到最佳状态。 这些参数或设置密切相关，选择时应综合考虑； 或使用 Aver key 和 Li.Ai。 扫描过程中图像平滑和降噪的关键（即简单的数学平均方法）。
另一种方法是在此基础上，图像扫描完成后，利用LCS软件中的图像处理功能键调节亮度、对比度和灰度校正，并通过基线校正去除噪声，以优化图像质量。 还有一种情况是，由于操作者用显微镜观察荧光样品后未能退出荧光滤光片并切换到扫描状态，导致明场出现环形波纹背景。 此时，只需转动调节轮即可进行扫描。
3. 串色
当使用多种荧光染料标记样品或样品本身具有较强的自发荧光时，很容易发生颜色交叉污染。 串色分为两种情况：
(1)两种荧光染料的激发光谱不重叠，但吸收光谱重叠。 这种类型的串色可以通过顺序扫描（也称为序列扫描）来完成：即先使用一种荧光染料的激发光扫描一张图片，然后使用另一种荧光染料的激发光扫描该章2 图片。
(2)两种荧光染料的激发光谱和吸收光谱重叠。 这种情况只能通过光谱扫描来解决。
4. 多荧光通道扫描图像的保存及标尺值的舍入
保存多通道扫描图像时，系统默认以不同的单通道颜色保存。 为了便于直观观察不同部位各种荧光的表达情况，我们还需要各种荧光叠加的合并图像。 这时，只需点击按钮即可。 单次扫描图像完成后，系统自动生成的标尺值大多数情况下都是非整数。 即使在保存图像之前将它们修改为整数，在后续扫描时，上一个图像中修改的标尺值也会恢复为默认值。 非整数值。 要解决这个问题，还需要使用功能键。 即单次扫描完成并修改标尺值并舍入后，单击按键显示合并图像，然后右键选择图片生成图像。 这两点很容易被新手用户忽视。
5、图像扫描完成后，忘记重置各种参数。
尤其是电子放大扫描后，很多操作人员忘记恢复ZOOM，导致下一次扫描样品时无法观察到显示屏上的目标样品。
06 “共焦显微镜”的维护
1、严格按照共焦显微镜操作规则使用，避免因使用不当造成损坏。
2、为了保持良好的工作状态，延长使用寿命，工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。 每次使用共焦显微镜后，应及时清洁目镜、物镜等易污染的光学部件。
3、共焦显微镜系统应有专门的房间，并安装在防震平台上。 工作室应安装空调、除湿、防尘装置。 无论仪器是否工作，其环境最好保持在22℃±1℃的恒温。
4、注意保护仪器光纤，防止受到挤压。 仪器常用备件和专用工具应由专人保管。
5、共聚焦显微镜工作室必须常年保持清洁卫生，操作人员必须穿拖鞋和工作服。
6、用户必须经过培训合格后，才能在管理人员的指导下使用共聚焦显微镜。
07 选择“共焦显微镜”的建议
共焦显微镜比宽视野显微镜有更多优势。 共焦显微镜可以对样品进行连续光学切片并消除非焦平面的信号干扰。 因此，共焦显微镜确实更常用。 然而，市场上的各种共焦显微镜越来越多。 如何选择？ 选择共聚焦显微镜时，最基本和重要的考虑因素主要有两点：您想要研究的样品类型（例如固定或活细胞），以及您想要执行的检测类型（例如静态或动态细胞过程） ）。
固定细胞的共焦成像
为了对固定和染色的细胞或组织进行成像，我们通常选择激光扫描共聚焦（LSCM）。 这主要是因为固定死细胞缺乏活细胞中的快速生物事件，可以更好地受益于LSCM更高的空间分辨率。 LSCM成像利用激光对样品进行光学切片，扫描速度（取决于扫描阵列的速度）一般为1fps。 更长的曝光时间意味着更大的光漂白风险，但对于固定的死细胞，时间并不重要，我们可以通过拍摄多张图像来平均。
活细胞共聚焦成像
活细胞成像需要额外的保护，以免受不友好环境的干扰。 在成像时，我们首先需要考虑的是维持细胞的活性和健康。 恒温加热元件和灌注系统至关重要，特别是对于延时（时间序列）研究。 控制活细胞生理状态的快速生化事件是大多数人想要研究的，但这些事件对于传统的 LSCM 来说太快了。 此外，长期暴露于LSCM还会对细胞造成有毒光损伤。 因此，活细胞成像需要特殊的共聚焦显微镜。
活细胞共焦成像通常有两种选择：快速扫描激光扫描共焦和转盘共焦。 快速扫描共焦显微镜取代了较慢的共振扫描阵列（速率），该速度理论上是可以实现的（实践中往往受到其他因素的限制）。
如果您担心光漂白或荧光信号非常弱，那么 SDCM 可能更合适。 SDCM利用两个带有阵列微孔的转盘旋转来分散激发光。 与LSCM逐点扫描样本不同，SDCM一次采集多个点（约100个像素），因此速度大大提高，而且SDCM的光漂白性和光毒性较小。 不过，也可以采用快速扫描共焦，提高扫描速度，配合高灵敏度探测器，降低激发光能量，以降低光毒性。 这样可以保证传统共焦的丰富功能。
自动共焦成像系统
一些研究人员喜欢寻找修改显微镜以满足其个人需求的方法。 一些研究人员根本对显微镜的工作原理不感兴趣。 对于后者，自动共焦显微镜可能更符合他们的喜好。 这类仪器非常适合每天需要收集大量图像数据的研究人员。 当然，它们并不能完全体现传统共焦的功能和灵活的可扩展性。
加深对各种共焦显微镜类型的了解可以帮助您找到最适合您应用的仪器。 如今，即使您不考虑全自动系统，无论您选择哪种型号，大多数系统都内置了丰富的用户友好功能偏光显微镜法观察聚合物球晶形态，可以让您受益匪浅。
如今，共焦显微镜不断向更快、更灵敏、更高分辨率和更好的可扩展性发展，新技术不断涌现。
速度方面有共振快速扫描头和转盘共焦；
灵敏度方面，有AOBS光谱系统和更灵敏的探测器（HyD、GaAsp PMT）；
分辨率方面，有超高分辨率（SIM、STED、PALM、STORM）；
此外，还有多光子、白光激光、SMD等技术。
在选择共焦系统时，我们可以听听各个厂家的介绍，以便我们了解这些技术，并根据我们可能进行的研究来选择最合适的仪器。 （作者：史密斯）
08“共焦显微镜”常见品牌
至此，相信您对共焦显微镜已经有了深刻的了解。 目前有哪些品牌的共焦显微镜？ 哪些最受关注？ （按品牌缩写字母顺序排列）
A.奥林巴斯
产品：
激光扫描共焦显微镜LEXT等
▲ 激光扫描共焦显微镜LEXT。 蔡司
产品：
高效共焦成像系统 LSM 900，配备 2
共焦显微镜等
▲ 高效共焦成像系统 LSM 900 配备 2
C.基恩士
产品：
形状测量激光显微镜VK-X3000等
▲ 形状测量激光显微镜VK-。 （尼维斯）
产品：
共焦显微镜等
▲ 共焦显微镜。 尼康
产品：
快速转盘共聚焦显微镜系统 CSU-SD
A1+激光共焦显微镜等
▲ 快速转盘共聚焦显微镜系统 CSU-SDF。 牛津仪器
产品：
高速共焦成像平台 Andor 等人。
▲ 高速共焦成像平台Andor。 阳光明媚
产品：
CSIM 100共焦扫描成像模块（系统）等
▲ CSIM 100共焦扫描成像模块（系统）
本文所介绍的品牌由仪器信息网的仪器购物指南提供。
大数据综合计算（品牌指数、3i指数等）
解释的最后权利属于仪器信息网络09个较大的“复活节彩蛋”
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