(1) 暗视野显微镜
(2)体视显微镜
(3)荧光显微镜
(4) 相差显微镜
(5)倒置显微镜
(6) 偏光显微镜
(1) 暗视野显微镜
暗视野显微镜不具备观察物体内部精细结构的功能,但可以区分0.004μm以上颗粒的存在和运动。 因此,常被用来观察活细胞的结构和细胞内颗粒的运动。
暗视野显微镜的基本原理是廷德尔效应。 当一束光穿过暗室时,从垂直于入射光的方向可以在空气中观察到一条明亮的灰尘“路径”。 这种现象就是丁达尔效应。
普通光学显微镜上暗场显微镜更换为暗场聚光镜后,由于聚光镜内部抛物面结构的阻挡,照射到被检物体表面的光线无法直接进入物镜镜头和目镜。 只有散射光可以通过,所以视野是黑暗的。 操作者通过目镜观察到的是被检物体的衍射光图像(图1-2)。
使用暗视野显微镜的基本方法如下:
1、安装暗场聚光镜(或者用一张厚黑纸做遮光罩,放在普通显微镜的聚光镜下即可得到暗场效果)。
2. 使用强光源,通常是显微镜灯,以防止直射光进入物镜。
3、在聚光镜和载玻片之间加入一滴雪松油,防止照明光在聚光镜上完全反射而不能到达被检查物体,造成暗场照明。
4、进行调心,即水平移动聚光镜,使聚光镜光轴与显微镜光轴严格一致。 升降聚光镜,将聚光镜的焦点(图1-2中锥束的顶点)对准被检物体。
5、选择与聚光镜对应的物镜,调节焦距,像普通显微镜一样操作。
(2)体视显微镜
体视显微镜也称为实体显微镜或解剖显微镜。 其图像为正立三维空间图像,具有立体感强、图像清晰宽广、工作距离长(通常为110毫米)、连续放大观看等特点。 在生物学中偏光显微镜补偿器的作用,它常用于解剖学过程中的实时观察(图1-3)。
普通光学显微镜的光源是平行光,从而形成二维平面图像; 而体视显微镜则采用双通道光路,双目镜筒内的左右光束具有一定的视角(通常为 ),从而形成三维空间的立体图像。
体视显微镜的使用与普通光学显微镜类似,但更方便。 两者之间的主要区别是:
1、体视显微镜检查的对象无需制作成封片膜。
2、体视显微镜载物台直接固定在镜座上,配有黑白双面板或玻璃板。 操作者可根据显微镜的对象和要求进行选择。
3、体视显微镜成像为直立,方便解剖操作。
4、体视显微镜只有一个物镜,通过旋转调节螺杆可以连续调节其放大倍数。
(3)荧光显微镜
荧光显微镜是利用细胞内物质发出的荧光强度进行定性和定量研究的光学工具。
细胞中有两种荧光物质。 一类受紫外线照射后可直接发出荧光,如叶绿素。 还有一些物质本身不具有这种性质,但如果用特定的荧光染料或荧光抗体染色,在受到紫外线照射后就会发出荧光。 照射后也可发出荧光(图 1-4)。
荧光显微镜的原理是利用高光效点光源(如超高压汞灯)通过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650λ或紫蓝光4200λ)作为激发光来激发样品中的荧光物质。 各种颜色的荧光发出后,经过物镜后面的阻挡(或抑制)滤光片过滤,最后通过目镜的放大倍数进行观察。
阻挡滤光片有两个作用:一是吸收并阻挡激发光进入目镜,避免干扰荧光,损伤眼睛;二是吸收阻挡激发光。 另一种是选择并让特定的荧光通过,以显示特定的荧光颜色。
荧光显微镜按光路原理可分为两种:
1.透射荧光显微镜
在较旧的荧光显微镜中,激发光源通过聚光镜穿过样本材料以激发荧光。 优点是低倍时荧光较强,缺点是随着倍率增大荧光减弱。 因此只适合观察较大的标本材料。
2.落射荧光显微镜
激发光从物镜向下落到样品表面,即照明聚光镜和收集荧光的物镜使用同一物镜(图1-5)。
光路中需要添加二向色分光镜(二向色镜),与光轴成45°角。 激发光反射到物镜中并聚集在样品上。 样品产生的荧光被物镜和盖子的表面反射。 载玻片表面反射的激发光同时进入物镜,返回二向色分光镜,将激发光和荧光分离。 然后剩余的激发光被阻挡滤光片吸收。 如果使用不同的激发滤光片/双色分束器/阻挡滤光片组合插片,则可以满足不同荧光反应产物的需求。
这种荧光显微镜的优点是视场照明均匀,图像清晰,放大倍数越大,荧光越强。
(4) 相差显微镜
相差显微镜是一种可以将光线通过物体时产生的相位差(或光程差)转换为振幅(光强)变化的显微镜。 主要用于观察活细胞、未染色的组织切片或缺乏对比度的染色标本。
人眼只能识别可见光的波长(颜色)和振幅的变化,而不能识别相位的变化。 大多数生物标本都是高度透明的,光波穿过它后振幅基本保持不变,只有相位发生变化。
相差显微镜基本上是将透过标本的可见光的光程差转变为振幅差,从而提高各种结构之间的对比度,使各种结构清晰可见。 光线穿过标本后发生折射,偏离原来的光路,并被延迟1/4λ(波长)。 如果增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光束合并后发生干涉。 加强、增加或减少幅度,并增加对比度(见图 6)。
从结构上看偏光显微镜补偿器的作用,相差显微镜与普通光学显微镜的区别是:
1、环形光阑有一个环形开口,安装在光源和聚光镜之间。 其作用是使通过聚光镜的光线形成空心光锥并聚焦在标本上。
2、相位板相差显微镜在物镜内部增加了一块涂有氟化镁的相位板,使直射光或衍射光的相位延迟1/4λ。 相位板上有两个区域,直射光通过的部分称为“共轭面”,衍射光通过的部分称为“补偿面”。 相位板按其工作作用分为两种:
(1) A+相位板:使直射光延迟1/4λ。 两组光波组合后,光波叠加,振幅增大。 标本结构比周围介质更亮,形成亮对比度(或负对比度)。
(2) B+相位板:使衍射光延迟1/4λ。 两组光线合成后,光波相减,振幅变小,标本结构比周围介质更暗,形成暗对比度(或正对比度)。 带相位板的物镜称为相衬物镜,在物镜外壳上常标有“Ph”字样。
同轴可调望远镜
相差显微镜配有同轴调节望远镜(外壳上标有“CT”符号),用于调节环形光阑,使图像与相位板的共轭面完全一致,从而实现对直射光和衍射光的特殊处理。 。
使用时,取下一侧目镜,插入望远镜调轴,调整轴即可调节望远镜的焦距,视野内会出现两个环,即较亮的环形光圈环和较暗的环形光圈环。共轭在相位板上。 面环。 然后转动聚光器上环形膜片的两个调节螺钉,使两个环完全重叠。 如果明亮的光晕太小或太大,请调节聚光镜的升降旋钮,使两个环完美匹配。 如果聚光镜已升到最高点或降到最低点仍无法校正,则说明载玻片太厚,应更换。 调整完毕后,可以拆下同轴调整望远镜,换上目镜。
绿色滤光片
用于调节光源的波长。 不同波长的照明光会引起相位变化。 为了获得良好的相衬效果,相衬显微镜需要使用波长范围较窄的单色光,通常用绿色滤光片进行调节。
使用相差显微镜的步骤如下:
① 根据被检样品的性质和要求,选择合适的相衬物镜。
② 将载玻片放置在载物台上,调整光轴中心。
③利用望远镜的同轴调节,调节环形光阑与相位板上的共轭面环完全重合,然后更换目镜。 在观察过程中,每次改变物镜放大倍数时,都必须重新调整环形光阑以与相位板共轭面的环相匹配。
④ 加绿色滤光片,按照普通光学显微镜的操作步骤进行观察。
(5)倒置显微镜
倒置显微镜的结构与普通显微镜基本相同,只是交换了物镜和照明系统的位置。 前者在台下,后者在台上。 主要用于观察培养的活细胞,需要配备相差物镜。
(6) 偏光显微镜
偏光显微镜可用于检测双折射物质,如染色体、胶原蛋白、纤维等(图1-7)
与普通显微镜的区别在于:
① 偏光显微镜在光源前面装有起偏器(偏光镜),使进入显微镜的光发生偏振。
②镜筒内有检偏器(检偏器,偏光方向与偏光器垂直的偏光器)。
③ 使用旋转台。 当单个折射物质放置在载物台上时,无论载物台如何旋转,由于两个偏光镜是垂直的,因此在显微镜中看不到光。 当放置双折射物质时,光穿过这种类型的材料。 物体被物体偏转,从而使旋转台能够检测到此类物体。
④ 配备补偿器或相位膜;
⑤ 使用专用无应力物镜。
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