关键词：–Barrvirus；B；；viral；
作者及单位：四川医科学院张晓副院长、厦门学院洪俊平博士、中山学院癌症预防中心钟玲博士等为论文共同第一作者。东莞学院癌症预防中心徐淼院士、厦门学院夏宁邵院士、厦门学院陈毅歆院士等为论文共同通信作者。
文章亮点
靶点gB的两株中和抗原3A3、3A5才能在体外及体内高效中和EBV感染；
3A3结合在gB中部的第II结构域细胞膜蛋白，3A5与gB腹部的第IV结构域结合，两个表位均为新鉴别表位；
3A3及3A5辨识的表位是免疫优势表位；
3A3及3A5通过不同的机制抑制膜融合过程。
实验设计
首先用重组gB蛋白免疫美国大白兔细胞膜蛋白，借助B细胞单克隆分选技术筛选得到具有高结合能力和中学和能力的两株兔源单克隆抗原3A3和3A5；随即通过体内、体外模型验证这两株抗原的中和活性，借助Cryo-EM解析抗体-抗原复合物结构并鉴别抗原辨识表位；因而通过与EB病毒健康携带者及肿瘤病人的血浆进行竞争实验，说明3A3及3A5辨识的表位在自然感染人群体内诱导抗原形成的优势性；
最后通过膜融合试验（如右图所示）研究抗原抑制膜融合能力及其表位在膜融合过程中发挥的作用，并利用细胞结合实验等生化方式进一步阐明3A3和3A5的中和机制。
主要实验方式
01B细胞单克隆分选技术筛选抗原
用gB蛋白免疫美国大白兔后，采集约5毫升血液，分离、收集外周血单核细胞（PBMCs）。将PBMCs用PBS重悬，加入生物素标记的gB蛋白，在4℃下孵育30分钟，PBS漂洗三次，800×g离心5分钟。而后借助LIVE/DEADAqua，mouseanti-CD4:FITC，mouseanti-CD8:FITC，mouseanti-T:FITC，mouseanti-IgM:RPE以及APC进行染色，而后使用BDFACSAriaIII细胞分选仪进行B细胞分选。将抗体阴性的B细胞分选到96孔板中，体外培养7天，搜集上清进行ELISA检查。最后，提取阴性B细胞的RNA，反转录cDNA，采用巢式PCR钓取抗体重链和轻链可变区，将PCR产物插入富含兔重链或轻链恒定区的载体中，借助293F细胞抒发重组抗原。
02膜融合试验
抗原抑制膜融合能力鉴别
效应细胞：HEK-293T达到80%汇合度时，转染2.5μg-gB、-gH、-gL和-T7（抒发T7DNA聚合酶）。受体细胞：HEK-293T细胞转染10μg（在T7启动子控制下抒发萤光素酶报告基因）。转染24小时后，将2×105效应细胞消化，加入20μg3A3、3A5、3A3+3A5和1E12在37℃下孵育30分钟。之后，将该抗原-效应细胞混和物与2×105受体细胞在24孔板中混和共培养24小时。根据Dual-Glo®assay()的说明，裂解共培养的细胞，定量萤光素酶活性。
抗原辨识的表位在膜融合中的作用探究
效应细胞：HEK-293T达到80%汇合度时，转染2.5μg-gB突变体、-gH、-gL和-T7（抒发T7DNA聚合酶）。受体细胞：HEK-293T细胞转染10μg（在T7启动子控制下抒发萤光素酶报告基因）。转染24小时后，将2×105效应细胞与2×105受体细胞在24孔板中混和共培养24小时。根据Dual-Glo®assay()的说明，裂解共培养的细胞，定量萤光素酶活性。
主要实验试剂
主要结果展示
013A3、3A5在体外可以中和EBV感染并明显抑制膜融合
两株抗原均可有效中和上皮和B细胞感染，再者也就能有效抑制膜融合过程。另外，在细胞感染阻断模型中联合使用3A3和3A5显示出较强的协同效应。
023A3及3A5通过不同的机制抑制EBV感染
在细胞膜融合模型中，3A3关热键点突变蛋白不影响gB的膜融合功能，而3A5的关热键点突变均可抑制gB的膜融合功能，说明3A5所辨识的表位对于gB在膜融合过程当中的变构至关重要，3A5可能通过制约gB变构而发挥中和功能。而3A3的表位与gB辅助受体NRP1的结合表位重叠，3A3所辨识关热键点突变后，gB不能与NRP1结合，说明3A3可能通过阻断gB与受体的结合而发挥中和疗效。
参考建议
1、双萤光素酶报告基因受多种诱因影响，非常是要保证细胞状态和转染效率等；
2、孔与孔之间读值差异较大，建议实验通常须要做3个或3个以上复孔；
3、裂解过程尽量在冰浴中进行；
4、样品发光值应当远小于背景值，通常起码在10万的读值以上。
不感兴趣
看过了
取消