膜片钳与单细胞RTPCR技术相结合应用于神经细胞研究进展[摘要]膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经细胞的研究，从电生理学和分子生物学角度阐明了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系，使单个神经细胞离子通道的生物化学学和毒理学特点得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA抒发。目前，这两种技术的结合已有多方面的应用，并取得了重要的进展。[关键词]神经细胞；膜片钳技术；单细胞RT-PCR[中图分类号]R34[文献标示码]A[文章编号]1673-7210（2008）04（a）-015-02膜片钳技术(patch-clamp)是1976年由Neher和[1]在电流钳基础上发展而至的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术。后经[2]等进一步建立，其电压检测灵敏度已达1PA,空间帧率达1m，时间帧率达10s，并已发展出许多适宜不同须要的记录模式。它能区分通过细胞膜单个通道的电压,对通道浊度及其动力学特点、药理学特点和调节机制进行研究，为通道分型提供了可靠标准；同时它扩充了电生理技术的应用范围，往年无法研究的喂奶类植物小细胞或延性很大的细胞等，均可采用膜片钳技术进行研究。
另外，应用膜片钳技术还可确切检测出与细胞分泌相关的膜电容的微小变化，因此它还是一种研究细胞分泌机制的电生理新方式。聚合酶链式反应（chain,PCR）技术是一种在体外由质粒介导的特定DNA序列的酶扩增，能快速特异的扩增所需目的基因或DNA片断，是一种用途广泛且有效的核苷酸扩增技术。目前，PCR技术已广泛应用于基因分离、克隆和核苷酸序列剖析，突变体和重组体建立，基因抒发调控研究及基因多态性剖析等。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）与cDNA的PCR相结合的技术。首先经反转录酶作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片断。RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可用于测量细胞中基因抒发水平，细胞中RNA病毒浓度和直接克隆特定基因的cDNA序列。膜片钳与单细胞RT-PCR相结合的目的是为了确定单细胞内多基因抒发的形式。该技术应用于神经细胞的研究,从电生理学和分子生物学角度阐明了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系,使单个神经细胞离子通道的生物化学学和毒理学特点得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA抒发。1基本原理等[3]于1991年首先将膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合上去，具体方式是:将逆转录酶、dNTP(DNA合成底物)及质粒等在膜片钳记录之前加到电极内液中，使细胞内mRNA在膜片钳记录过程中即被逆转录生成cDNA，之后对生成的cDNA进行PCR扩增细胞膜片，扩增产物通过凝胶电泳进行剖析。
这两种技术的结合可对形态相像而电活动不同的细胞作出分子水平的解释。1995年，法国耶鲁学院医大学的和耶鲁学院的[4]在刊物上发表文章，首次介绍了膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合在单个神经元研究中的应用，在完成对神经元离子通道的毒理学和生物化学学特点观察后，研究同一细胞上特异mRNAs的抒发情况。其具体操作是:在严格避免RNA酶污染的条件下先完成全细胞膜片钳记录，再将该细胞内容物吸入到记录电极中,之后用所研究的离子通道亚单位特异性质粒将取自单细胞的mRNA逆转录成cDNA后进行PCR扩增，从而测量特异的mRNA。膜片钳技术既可以对单细胞电生理功能进行研究，又可以利用其电极产生的吸收通道，汲取单个细胞，对其进行单细胞水平的分子生物学研究。依靠于膜片钳电极，在相差显微镜观察下，直接用电极将待选定的单个细胞汲取下来，将其转到管，之后进行RT-PCR.2研究进展2.1剖析神经元离子通道等[5]运用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，对成年鼠额叶和颞叶蒲肯野神经元中的CaV2.1转录本进行抒发剖析，发觉单个脑干蒲肯野细胞即使抒发多种CaV2.1转录本，但其种类比脑干中的少。
他提出不同类型的CaV2.1转录本可在不同脑区和脑神经元中进行选择性抒发。I等[6]应用膜片钳和单细胞RT-PCR研究2种不同类型喂奶植物的可激动细胞（海马神经元和非神经毛发囊状上皮细胞），发觉在这两种细胞中Nav1.2mRNA和Nav1.6mRNA抒发最多,而Nav1.3mRNA和Nav1.7mRNA分别在胚胎海马神经细胞和婴儿的毛发囊状上皮细胞有适度抒发。Liu等[7]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，在分离的2~5个月的SD雌性小鼠前舌蕈状嗅觉体会器细胞上研究延后检波钾(DRK)通道的抒发，发觉其上有许多种来自KCNA,KCNB和KCNC亚家族的DRK通道，其中Kv1.5通道(KCNA5)是蕈状嗅觉体会器细胞主要的DRK通道。2.2观察神经元受体分布等[8]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术剖析新生幼鼠脑干交感神经元固醇受体mRNA的抒发，观察到75％交感节前神经元抒发H1受体的mRNA而未抒发H2，H3和H4受体的mRNA。该研究首次报导了交感节前神经元中抒发H1受体，并猜测胺类通过对H1受体直接的突触后效应对交感节前神经元的激动性进行调节。
JuliaE.Fries等[9]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究增殖性玻璃体黄斑肿瘤患者黄斑Müller细胞中P2Y受体亚型的类型，发觉Müller细胞抒发P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受体。OA等[10]在急性分离的TM神经元中,运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究AMPA受体特点。发觉所有神经元上都有AMPA受体GLUR2的mRNA，75%的神经元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）,GLUR3（0％）。2.3剖析神经元的分子基础L等[11]运用膜片钳、单细胞RT-PCR及无监督降维剖析方式,根据电生理特点和分子参数的不同把小鼠侧燕麦核神经元分成五类。第一类是投射神经元，这种神经元具有低领取频度，对常年去极化剌激具有频度适应性等电生理特点并抒发囊泡膜丁酸转运体1（）。其依据电紧张性的不同和是否存在血管活性肠肽（VIP）又分classIA和classIB两类。其余四类都是富含氨酸脱羧酶(GAD67)的中间神经元。第二类神经元形成快速棘波，并伴有一些初期的频度适应。第三类神经元无频度适应而形成快速棘波，它与第两类神经元的区别在于前者存在VIP和相对较少的神经肽Y(NPY)及生长抑素(SOM)。
第四类和第五类通过分子标记不能明晰区别，但可依照膜电位值和棘波图形的不同进行分辨。HüK等[12]通过膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究顽固性脑膜脑炎患者的侧燕麦核神经元特点，发觉投射性神经元具有棘状树突,不同程度频度适应性的动作电位和γ-羧基谷氨酸受体耦联的外向检波K+通道(Kir)。而中间神经元的树突无棘或极少棘,动作电位小且经常是自发的,且无γ-羧基谷氨酸受体。单细胞RT-PCR发觉，在投射神经元中抒发Kir通道亚型Kir3.1和Kir3.2及囊泡膜丁酸转运体和；而中间神经元也抒发Kir通道亚型Kir3.1和Kir3.2，但其缺少和受体。结果表明,依据形态学、电生理和分子生物学标准可以分辨人脑燕麦核投射神经元和中间神经元。2.4研究抗生素对神经细胞的作用ZhongCB等[13]运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术剖析急性分离的东莨菪碱诱导的认知缺损的小鼠海马锥体神经元延后检波钾电压的特点以阐明由胆碱能损伤造成记忆缺位的离子机制。他发觉海马锥体神经元IK电压密度减小、振幅峰值变高；Kv2.1mRNA降低,而Kv1.5mRNA没有显著的改变，提示海马锥体细胞Kv2.1mRNA抒发降低可能是IK降低的缘由及东莨菪碱诱导记忆缺陷的离子基础。
MarkFry等[14]应用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术剖析了对小鼠最后区（AP）神经元的作用，观察到60％小鼠AP神经元对敏感，且对敏感的所有AP神经元均抒发and两种受体。3展望膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经科学领域的研究,从分子生物学和电生理角度阐明了神经细胞的功能活动与结构之间的相互联系，也促使检查单个细胞的基因改变成为可能。该技术才能精确地研究特定单细胞的基因抒发，成为研究功能基因组学的有力工具。而许多癌症的发生都是因为单个细胞的分子改变导致的，因而确切地找到发生改变的细胞对于癌症的确诊、机制的研究及预防都有重要的意义。但因为对技术的高度要求以及对外界干扰的高度敏感细胞膜片，单细胞RT-PCR的应用遭到了一定的限制。为此这项技术在体系上有待于进一步的建立，在应用上有待于进一步的扩充。[参考文献][1]NeherE,B.-fromoffrog[J].,1976,260(5554):799-802.[2]OP,MartyA,NeherE,eta1.patch-clampforhigh-fromcellsandcell-free[J].Arch,1981,391(2):85-100.[3]J,YehH,K,eta1.ofgeneinLive[J].PANS,1992,89:3010-3014.[4]NJ,DL.PCRandpatch-clampof[J].,1995,14(6):1095-1100.[5],W.,C.Payne,aofCav2.1incellsthaninthe[J].,2006,24(2):86-96.[6]I,F,C,eta1.of-gatedalphainandnon-cells[J].,2005,130(2)：389-396.[7]Liu,DaneR,,Kim,eta1.andofK+inrattastebuds[J].Cell,2005,289:C868-C880.[8]AD,AM,LeeK,eta1.ratinvitroviaofH1[J].,2006,95(4):2492-2500.[9]JuliaE.Fries,IwonaM.,-,eta1.ofP2YinHumanMüllerGlialCellsby,CellRT-PCR,and[J].VisSci,2005;46:3000-3007.[10]OA,BT,VS,eta1.AMPAandwith-inrat[J].,2004,19(4),957-965.[11]L,MeisS,G,eta1.ofandintheratbasedupon[J].And2006,33(1):57-67.[12]HüK,-HankeD,G,eta1.andofinthehuman[J].And,2006,31(2):210-217.[13]ZhongCB，PanYP，TongXY,eta1.andKv2.1mRNAinof--rats[J].,2005,373(2):99-104.[14]MarkFry,M.Smith,TedD.Hoyda,eta1.AreaArebythe[J].Theof,2006,26(38):9695-9702.（收稿日期：2007-10-16）