文|心兰书华
编辑|心兰书华
«——【·引言·】——»
克雷伯氏菌噬菌体是特异性感染真菌的噬菌体，新生的克氏噬菌感受破坏寄主细胞，释放出更多的噬菌体颗粒，本文我们研究微量生物膜对噬菌体KP34感染和抗生物膜能力的优势，以及微量生物膜在噬菌体诊治中的稳定性和可操作性。
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌体KP34对解聚酶抗生物膜中凸显出一定的优势和局限性，虽然微量生物膜才能提供一个稳定的环境，保护噬菌体KP34免受外界环境的不利影响，并增强其抗生物膜活性。
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«——【·噬菌体KP34的抗生物膜活性·】——»
在研究开始时，在不同含量或效价的面板上分别测定每种抗生素的抗生物膜活性，裂解噬菌体KP34活性测试两个效价，菌落计数法和活/死细胞试剂盒被觉得是用噬菌体处理时生物膜清除检测的最有效方式。
事实证明，两种噬菌体效价都还能在2-3个对数的范围内明显降低菌落计数，用39PFU/ml，对于生物膜产生的所有阶段，细胞百分比从0%增加到001.0%，从统计学上明显增加，由噬菌体感染造成的真菌细胞裂解也造成生物膜结构龟裂，而裂解的细胞释放其DNA打算与碘化丙啶结合。
这意味着更少的活细胞数目和更多的从死细胞释放的游离DNA是活/死比明显下滑的诱因。当施用高噬菌体效价时，结晶值在94h，60h和67h生物膜中分别可视化生物膜生物量降低24%，48%和72%，较低的噬菌体效价（/ml）仅降低了24小时生物膜，而对较旧的生物膜没有统计学上的显着影响。
噬菌体饲养水平可能太低而难以造成生物膜龟裂，部份降解的生物质（带负电荷）与大量结晶紫分子互相作用，为了进一步研究联合抗生物膜医治，介于108选择PFU/ml噬菌体效价以观察抑菌剂组合可能改善的疗效。
在真菌草皮上连续稀释验证所制备的重组酶的降解活性，并通过酶谱测定法提取的哮喘克雷伯菌77荚膜黄酮，在抑菌膜实验中，测试了四种含量的解聚酶：7.5ng/ml，75ng/ml，750ng/ml和7500ng/ml，无论生物膜年纪怎样，在与酶孵育2小时后，测试含量均未造成菌落计数的显着变化。
研究剖析表明，真菌软膏的降解不会造成细胞死亡，2小时孵育不足以从生物膜基质中释放无柄细胞，真菌活力试剂盒的应用否认，用24MHF处理1小时生物膜和用72MHF含量处理10小时生物膜仅造成轻微的，统计学上不显着死亡率增加，解聚酶处理预计不会影响活/死细胞的比列，由于它不会造成细胞死亡或细胞膜损伤，这种结果与CFU计数方式一致。
相反，结晶紫染色表明在施加每种解聚酶含量后生物膜生物量降低，与对照样品相比，最高范围为164–190%，解聚酶处理48h和72h生物膜诱导的变化有统计学意义，因为任何测试的酶含量对菌落计数和活/死细胞百分比没有显着影响，我们决定选择10MHF进行进一步研究，该含量对72h-龄生物膜比增加的影响最大。
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«——【·环丙沙星的抗生物膜活性·】——»
在为底栖麻疹克雷伯菌77细胞构建的MIC含量下测试环丙沙星的灭菌疗效：4MIC=1μg/ml，2MIC=0.5μg/ml，1MIC=0.25μg/ml和0.5MIC=0.125μg/ml，每位测试含量造成两小时处理后菌落计数在统计学上显着增加。
用0.5MIC处理的成熟生物膜的影响最低和嵌入初期生物膜的细胞降低1.2对数，降低药物含量更有效地降低1到2.6个对数之间的菌落计数，从初期到成熟的生物膜开始，活/死细胞比增加了29%，50%和4%，对初期和成熟生物膜的影响具有统计学意义，而48小时生物膜没有遭到损害。
较低的药物含量造成不显着的变化，只有2MIC的环丙沙星显着增加了（58%）嵌入初期生物膜中的细胞的比列，选择含量为4MIC的环丙沙星进行进一步研究，由于它对成熟的生物膜有效。
结果与菌落计数方式获得的数据不一致，其中每种药物含量对CFU数有显着影响，这种差别可能基于环丙沙星的作用形式，其造成真菌细胞死亡，但不造成真菌细胞裂解，在这些情况下，死细胞可能难以被碘化丙啶有效穿透，因而没有观察到活/死细胞百分比的减少。
用解聚酶和解聚酶噬菌体KP34处理生物膜后未观察到显着差别，相比之下酶与噬菌体KP15结合容许噬菌体感染，CFU降低2.6个对数，生存比降低75%，解聚酶使噬菌体KP15受体曝露和感染后细胞膜损伤，由于噬菌体KP15受体隐藏在真菌囊下，当噬菌体KP15与携带解聚酶的噬菌体KP34共同感染时，观察到类似的疗效。
研究结果得出最有效的药物膜组合是：环丙沙星与噬菌体KP34，解聚酶形成噬菌体KP34与解聚酶非携带噬菌体KP15，以及两种噬菌体都与药物混和。
对于上述组合，测量到生物膜清除的水平为菌落计数降低4-5.7个对数，生存比增长82-94%，生物量降低34-53%，用富含解聚酶、解聚酶-非携带噬菌体KP15和环丙沙星的三重混和物处理生物膜，造成高CFU和活死比增加，CV染色方式表明，大多数解聚酶应用样品的生物量显着降低。
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«——【·不同生物膜检测监测的优点和局限性·】——»
菌落计数仅显示可培养真菌，这意味着未检查到活但不可培养的真菌亚群，更重要的是，因为生物膜结构和真菌细胞集聚的不当分离，细胞计数很容易被高估，在抗生素和噬菌体处理中显示出最强的CFU减少，但仅限于前者，它也伴随着生物量降低。
碘化丙啶真菌活力试剂盒，以碘化丙啶为化合物也具有与抑菌剂的作用形式相关的局限性，应当指示死细胞的颜料只有在真菌细胞膜损坏时才会穿透和染色DNA，按照常见的活力标准，难以在合适环境中饲养的真菌应标记为“死亡”，但若果细胞膜保持不渗透性，则在用碘化丙啶染色时将其评分为“活”。
在研究的过程中，用环丙沙星处理的成熟生物膜在菌落计数中降低了2个对数，因而可以预期活/死比减小应当在99%左右，而实际上，它只有50%，环丙沙星是一种属于氟喹诺硫醇抗生素的灭菌药物，作用于拓扑异构酶IV和DNA旋转酶，阻断复制过程和细胞分裂。
从理论上讲，死亡的微生物丧失了保持其膜完整的能力，这应当使碘化丙啶才能渗透到细胞中，研究表明，CFU计数与染色的不一致结果来自环丙沙星在分裂过程中停止的狭长细胞的产生，因而与未经处理的培养相比，活死比一直相对较高。
虽然杀害真菌细胞，生物膜基质也可能不会被消除，成为生物膜再生的起点，因而我们使用的第三种方式是结晶紫染色，CV作为带正电荷的染色剂与带负电荷的成份结合，任何造成带负电荷的残基降低的抑菌剂也会提高CV复合物的产生，进而错误地解释生物膜生物量扩大。
在本研究中，生物量染色仅在高MOI下施用裂解噬菌体时才显示出清除疗效，而在其余情况下，生物量虽然降低了，这可能是因为带负电荷的寡糖过度生产或因为从死细胞释放并被困在基质中的带负电荷的组分降低，或因为噬菌体传播解聚酶的EPS/CPS酶降解的影。
其他研究证明了结晶紫染色解聚酶处理的效率，这与我们的研究结果相反，我们观察到解聚酶处理后生物量大量降低，还必须指出的是，生物量水平的差别也可能是因为：生物膜产生速度的差别，生物膜结构和基质组成，以及酶效率增加，除了这么，CV染色结果的可变性可能是因为技术方案导致的。
依据所选择的抗生物膜剖析方式，抑菌活性的结果可能会有很大差别，因而必须了解所应用剂的作用形式，为了正确剖析抑菌剂的有效性，应应用多重检测微量滴定方式，但是必须考虑到每种技术的生物和物理背景来验证结果。
由此得悉，富含解聚酶、解聚酶-不携带噬菌体KP15和环丙沙星的三重混和物也增加了高CFU和活死比，噬菌体KP34本身的裂解活性以及与其他抑菌剂组合具有令人满意的抗生物膜潜力，源端粒菌体KP34的解聚酶可用作解聚酶，不携带噬菌体的支持性抑菌膜剂。
«——【·结论·】——»
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌体KP34对解聚酶抗生物膜中诠释出明显的优势，微量生物膜为噬菌体提供了稳定的环境细胞膜损伤，保护其免受外界环境的不利影响，通过黏附于生物膜表面，微量生物膜才能促使噬菌体与生物膜之间的接触，增强感染效率和解聚酶活性，与此同时，解聚酶还能否限制抗生物膜的生长和扩散，提高噬菌体的抗生物膜能力。
参考文献：
约翰·史密斯，《克雷伯氏菌属作为院内病支原体》
迈克尔·约翰逊，《环境脑炎克雷伯菌分离株的致病潜力》
大卫·戴维斯，《抗生素渗透限制在克雷伯菌生物膜》