英文摘要
新型冠状病毒脑炎大流行在全球范围内引起严重的公共卫生危机。为防治新型冠状病毒（acute2，SARS-CoV-2）对健康带来的不利影响，不同类型、不同生产工艺的SARS-CoV-2卡介苗陆续被研制，包括减毒活卡介苗、核酸卡介苗、病毒载体卡介苗、灭活卡介苗和重组蛋白卡介苗等，而病毒表面的刺突蛋白是SARS-CoV-2卡介苗的研究热点。此文主要介绍SARS-CoV-2刺突蛋白的结构、功能与免疫学特点，以及相关SARS-CoV-2卡介苗的研究情况、安全性、适用性等，并讨论潜在问题解决举措。
正文
新型冠状病毒（acute2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒脑炎（COVID-19）在我国传染病预防法中被划入乙类传染病，采取甲类传染病的防治举措。截止2022年3月15日，依据WHO发布的相关疫情统计数据，全球累计诊断已超过4.5亿例，累计死亡超过600万例。面对这么严峻的形势，各国研究人员推进了研发SARS-CoV-2卡介苗的脚步。本文就SARS-CoV-2刺突（spike，S）蛋白的结构、功能以及基于S蛋白的SARS-CoV-2卡介苗的安全性和适用性等潜在问题展开综述。
S蛋白结构、功能及其受体
1.1
S蛋白的结构与功能
SARS-CoV-2的S蛋白为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白，是由3个相同的亚基通过非共价键的形式结合产生的同源三聚体[1]，其相对分子质量为141178，富含1273个多肽[2]。完整的S蛋白由胞外器件、跨膜部份和胞内C片断构成，胞外器件由甲基端的S1和甲基端的S2两个亚单位构成。其中，球状的S1负责介导病毒与胞膜受体结合，柄状的S2负责介导此后的膜融合过程。S蛋白冠部由3个S1亚单位构成，茎部由1个S2亚单位构成[3]。SARS-CoV-2S蛋白的多肽序列与SARS冠状病毒（SARS，SARS-CoV)的序列有约75%的同源性[4]。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S1亚单位序列相像性接近70%，而S2亚单位有接近99%的相像性[5]。
1.2
S蛋白的受体
SARS-CoV-2的细胞受体血管紧张素转换酶2（-2，ACE2）是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。目前觉得，在SARS-CoV-2感染中，ACE2为病毒步入细胞的主要受体。除ACE2外，Ⅱ型跨膜氨酸蛋白酶（typeⅡ，）也在SARS-CoV-2感染细胞时发挥重要作用，两者同时在Ⅱ型肺脏细胞中共同抒发。ACE2作为含锌羧肽酶的Ⅰ型跨膜蛋白，多抒发于肝脏、心脏和女性生殖系统，同时也在肺、小肠和肾脏等组织中抒发[6]，见图1。
部份COVID-19病人临床早期的表现诸如腹痛、腹泻等病症，可能与ACE2在肝脏的分布有关[7]。ACE2已被证明是SARS-CoV的S蛋白感染肺脏细胞时的主要受体[6]。ACE2有两类功能：一是作为催化活性的蛋白酶降解血管紧张素Ⅱ；二是作为受体介导SARS-CoV-2的入胞，即ACE2的非蛋白依赖。为此，病毒可通过ACE2的非蛋白依赖功能感染人体，导致ACE2蛋白浓度的降低和功能的衰退[8]，使肺的相关组织出现不同程度的损伤。SARS-CoV-2感染的人ACE2转基因大鼠具有间质性肾炎的典型病理学表现，而感染SARS-CoV-2的野生型大鼠则无上述病症[9]。另外，SARS-CoV-2易感染抒发ACE2的细胞，但不易感染未抒发ACE2的细胞。且等[10]研究表明，ACE2在SARS-CoV-2入胞过程中发挥的作用难以被酰基肽酶N等跨膜糖蛋白取代。为此，SARS-CoV-2可借助ACE2作为步入细胞的受体。则用于S蛋白的活化过程。在碱性条件下，SARS-CoV-2与Ⅱ型肺脏细胞的结合后可激活S蛋白细胞膜糖蛋白，使其切割质膜步入细胞，在推动膜融合以及病毒的入胞过程中发挥重要作用[11]。SARS-CoV-2通过S蛋白结合、感染细胞后，可使后者粘附并感染健康的细胞，加速病毒传播[12]。抒发和ACE2的细胞被SARS-CoV-2感染的风险，比不抒发和ACE2或只抒发其三的细胞急剧增强[13-14]。
S蛋白与受体的互相作用
2.1
受体结合域（，RBD)作用下的结合过程
S蛋白主要由讯号肽、N端结构域、RBD、融合肽段、七肽重复序列(，HR)1、HR2、跨膜结构域、胞质结构域等构成，同时具有S1/S2与S2´两个切割位点[5]。S蛋白的多肽次序如图2所示[17]。相关研究显示，HR1和HR2会在S1的RBD与靶细胞的ACE2结合后，产生融合核心（6-HB），提升病毒融合和感染的效率[19-20]。
2.2
SARS-CoV-2主要突变位点剖析
自SARS-CoV-2被发觉以来，全世界范围内已有20多个变异株，截止2022年1月7日，WHO定义了5个关切变异株（of，VOC），即阿尔法(α)、贝塔(β)、伽马(γ)、德尔塔(δ)和奥密克戎(ο)。
如图3所示，α变异株RBD中存在1个突变N501Y，提高了S蛋白与受体ACE2的亲和力细胞膜糖蛋白，在提升感染力的同时提高自身的免疫逃逸。β变异株存在3个坐落RBD的突变K417N、E484K、N501Y，提示该变异株具有较高的传播力和感染力，并在一定程度上减少卡介苗的中和活性。γ变异株存在3个坐落RBD的突变K417T、E484K、N501Y，与β变异株相像，可能增加卡介苗的中和活性。δ变异株S蛋白存在8个突变，2个（L452R和T478K）在RBD。ο变异株在RBD上存在15个突变，包括E484A、K417N等与免疫逃逸相关的突变，提示其可能具有很强的耐药性和免疫逃逸能力。表1列表统计整理了上述5个VOC，并简略剖析其突变结果。
VOC在RBD的突变呈现递增趋势，使得卡介苗的中和活性增长。全球首个ο血浆中和试验显示，卡介苗接种者血浆对ο变异株的中和活性仅为原始毒株的1/22[21]。SARS-CoV-2S蛋白的484和417位多肽的突变与免疫逃逸有关，β变异株的E484K、K417N突变，γ变异株的K417T突变都在不同程度上增加了临床使用的单克隆抗原（单抗）的中和作用，存在相像变异的ο变异株可能对针对该类位点的单抗形成抗药性。而K417N、Q493R、N501Y、N505H的突变，可能会提高病毒与ACE2的结合能力并降低其感染性[22]。其中，K417N突变可通过推动RBD与ACE2结合的方法促使入胞。而非RBD的突变，如S1/S2Furin蛋白酶裂解位点附近的3个突变H655Y、N679K、P681H，前三者可提升ο变异株的免疫逃逸能力，在增强对单抗的抗性方面起重要作用；P681H突变促使Furin蛋白酶与S蛋白的结合亲和力提高，此突变也见于α变异株，可能有利于病毒步入寄主细胞。上述突变造成ο变异株的再感染风险、免疫逃逸风险提升，且提升了重复感染的可能性。
SARS-CoV-2S蛋白卡介苗的研制及应用
3.1
S蛋白相关卡介苗研制现况
目前处于临床试验阶段的SARS-CoV-2卡介苗为112种，处于临床前试验阶段的有183种。基于WHO的卡介苗研制数据[23]，依据临床试验阶段卡介苗相关信息并参考部份文献[24]，表2列举了全球步入临床试验的基于S蛋白的COVID-19卡介苗。
3.2
S蛋白相关卡介苗使用现况
截止2022年1月7日，有32种SARS-CoV-2卡介苗已上市或获准紧急使用[25]，其中使用时间较长的6种卡介苗（保护率）分别为：法国赛诺菲/美国公司（95%[26]）、美国公司（94.1%[27]）的mRNA卡介苗，日本牛津学院/诺华公司（70.4%[28]）、美国强生公司（日本72%、拉丁欧洲66%、南非57%[29]）的腺病毒载体卡介苗，上海生物制品研究所有限责任公司、北京科兴生物制品有限公司的灭活卡介苗（法国50.65%、土耳其91.25%[30]）。
除上述较常规的卡介苗，诸多如气溶胶腺病毒卡介苗、鼻喷卡介苗、口服卡介苗等新型卡介苗正在研制中。
3.3
不同类型的含S蛋白卡介苗相关问题
3.3.1灭活卡介苗灭活卡介苗在疫情早期发挥了较大的作用，对SARS-CoV-2变异株B.1.429和α变异株仍保持免疫效力，但对其他VOC的疗效并不理想，比如β、γ变异株的血浆中和效率明显增加[31]。
灭活卡介苗相对稳定，安全性较高，生产工艺简单，但接种1针诱导的免疫应答水平较低、时间较短，须多次接种以强化免疫疗效，但是通常须要佐剂。同时，灭活卡介苗的安全性应严格把关，须重点关注卡介苗制备前的灭活疗效。
3.3.2减毒卡介苗日本的MV-014-212和美国血浆研究所/日本公司的COVI-VAC均为鼻内接种的减毒卡介苗，Ⅰ期临床试验疗效良好，未出现不良反应，也没有检查到野生型病毒。后者对β变异株有效[32]；前者可对α和β变异株形成稳定的血浆中和抗原[33]。
减毒卡介苗能诱导机体形成与自然感染相像的免疫保护作用，与灭活卡介苗相比，免疫原性强、作用时间持久，但保藏气温要求较为严格，但是病毒可能出现毒性回复等问题。因为减毒卡介苗保留一定毒性，对免疫力低下人群不适用。
3.3.3重组蛋白卡介苗重组S蛋白SARS-CoV-2卡介苗的研制主要针对S1亚基设计。其中，日本公司的亚单位卡介苗NVX-在波兰的Ⅲ期临床试验有效率达89.3%，在法国的Ⅱb期临床试验显示其对变异株501Y.V2的有效率达92.6%[34]；山东智飞龙科马生物药业与中国科大学微生物研究所联合研发的重组RBD蛋白亚单位卡介苗[35]已在吉尔吉斯斯坦上市，成为首个获准临床使用的SARS-CoV-2重组亚单位卡介苗。
重组蛋白卡介苗借助基因工程技术在体外抒发修饰基因，比其他卡介苗纯化程度更高，但免疫原性较低，抗体表位未能长久维持。可应用佐剂、颗粒免疫原、纳米针、表位重组等技术提升卡介苗的免疫原性[34]。糖基化S蛋白的纯化及融合前构象的稳定，佐剂、病毒蛋白载体的合理选择等均是须要关注的问题[36]。抗体的选择也是须要关注的问题，适合的抗体可以防止何必要的安全问题。另外，还应考虑到抗原持久性，探求持久性不高带来的接种次数过多的问题。
3.3.4病毒载体卡介苗上海学院和上海万泰生物制药股份有限公司联合研发的复制型病毒载体卡介苗-2019-nCoV-RBD-OPT1，以NS1基因缺位的麻疹病毒为载体，抒发S基因的RBD序列，并通过鼻内喷雾的方式给药，剂量为注射式卡介苗的1/5，已步入Ⅲ期临床试验[37]。非复制型病毒载体卡介苗目前有强生公司卡介苗（人腺病毒26）、军事医学研究院/康希诺生物股份公司的Ad5-nCoV卡介苗（人腺病毒5）、牛津学院/礼来公司卡介苗（黑猩猩腺病毒）等。Ad5-nCoV卡介苗插入S基因优化序列，Ⅰ期临床试验受试者接种后全部形成抗原，不同剂量组耐受性均较好，无严重不良反应[38]。另二者针对变异株的保护水平均有增长[39]。
病毒载体卡介苗通过病毒将目的基因在胞内抒发抗体，免疫过程与自然感染接近，可激活机体的汗液免疫，同时激活低毒的细胞免疫及粘膜免疫，具有安全性高、免疫原性高、作用时间长等优点。但特定人群可能曾感染用于载体的病毒，造成对其存在普遍免疫，体内还可能存在该载体病毒的中和抗原，致使抗原依赖性提高（-，ADE)，增加卡介苗疗效。
3.3.5核苷酸卡介苗核苷酸卡介苗是一种基于DNA或RNA研制的卡介苗，将蛋白的基因直接导出细胞，诱导更快速的免疫应答。
3.3.5.1RNA卡介苗编码分泌S蛋白三聚体RBD的、编码全长S蛋白的均为针对SARS-CoV-2的mRNA卡介苗，导致的免疫应答相像，但不良反应发生率更低，但是老年人接种30μg后7和14d的50%、90%中和抗原几何平均效价均超过了恢复期血浆组[40]。目前已在俄罗斯紧急授权使用。的以色列大规模接种呈现了较好的保护疗效，全体保护率为95.3%，感染保护率97%，无病症感染保护率91.5%[41]。另一卡介苗mRNA-1273免疫效力与相像[42]。
RNA卡介苗生产周期较短、设计制备过程较易、研制成本较低，可以通过修改抗体序列较好地应对病毒变异等问题。因为该类卡介苗不与寄主细胞基因组接触，因而避开了基因整合的风险。但该类卡介苗的运输储存条件较为严苛，且因为缺少技术积累，体内递送等方面存在一定弱项。
3.3.5.2DNA卡介苗日本药业公司与上海艾棣维欣生物技术股份公司联合研发的DNA卡介苗INO-4800为全长S蛋白卡介苗，Ⅰ期临床试验未出现严重不良反应，接种第2剂后安全性和耐受性良好[43]。INO-4800可以针对SARS-CoV-2VOC形成稳定的细胞免疫力，并保持良好的中和抗原和T细胞活性[44]。
DNA卡介苗制备不涉及病毒的复制、基因抒发，有着较高的安全性。DNA卡介苗可在体内常年抒发，并通过寄主细胞诱发细胞和汗液免疫，导致更强的免疫保护作用。并且DNA比较稳定，可在标准冷冻气温（2~8℃）保藏较长时间，在存储和运输方面有优势。但引物DNA可能会诱导自身免疫应答，增加卡介苗作用。常年抒发外源抗体还可能导致机体的免疫耐受，或因抒发水平较低被中和抗原消除，丧失防治疗效。同时，外源DNA有整合入寄主细胞基因组的风险。
3.3.6纳米颗粒卡介苗纳米颗粒卡介苗可以提供莱西度抗体表位[34]，但是与蛋白亚单位有着相像的结构，能有效激活免疫系统形成良好的免疫应答。目前有5种该类型的COVID-19卡介苗步入Ⅲ期临床试验。同时，对刺突蛋白-铁蛋白纳米颗粒（spike，SpFN）卡介苗的研究显示，该卡介苗可诱导有效的免疫应答，并且可能对SARS-CoV-2变异株以及其他冠状病毒提供广泛的保护，SpFN卡介苗单次免疫K18-hACE2大鼠形成的抗原被动免疫大鼠，可抵抗致死剂量病毒功击，但是低剂量抗原不会降低ADE风险[45]。
纳米颗粒卡介苗因不含核苷酸，不能自主复制，故不具有传染性，并且可通过抗体呈递平台改善抗体呈递的时间，以实现常年免疫，是一类极具借助价值的卡介苗。但该类卡介苗的作用机理较为复杂，也可能导致免疫病理反应，卡介苗的安全性还有待探究。
3.4
卡介苗面临的挑战
3.4.1SARS-CoV-2的基因变异在全球COVID-19大流行的背景下，SARS-CoV-2的突变机率大大降低。尤其是在δ毒株变异影响下，卡介苗的免疫效力开始增加[31]。虽然这么，卡介苗的保护效力仍然存在[46]。2021年11月于加拿大出现的ο变异株在RBD上有15处突变，并在P681H和N679K形成有别于其他变异株的突变，可能使其逃逸免疫系统的能力提高。并且该变异株多达30处的变异位点，可能使之在一定程度上逃避T细胞免疫[47]。因而应持续关注SARS-CoV-2的抗体表位的变化，重点关注S基因的诸位点。而S2亚单位的可变性要大于N端结构域，通过设计针对S2亚单位的单抗可减缓S基因突变带来的影响。还应关注SARS-CoV-2其他基因的位点改变，关注抗体甩尾情况，以应对可能出现的病毒变异风险，及时作出反应。
3.4.2ADE风险在关于SARS-CoV-2的临床研究中，有研究者发觉SARS-CoV-2有ADE的风险[48-49],即抗原可在一定程度上协助病毒步入靶细胞，增强感染率。SARS-CoV在研究中已被否认有ADE效应[2],其与SARS-CoV-2除了在基因序列上重合度高，但是在卡介苗设计的重点位置S1和S2上也存在很高的同源性[4-5]。虽然刘斌等[50]的研究表明SARS-CoV-2感染导致ADE的风险很小，而且在δ变异毒株中ADE效应却有所诠释。为此，在关于SARS-CoV-2的细胞粘附、体内传播等方面应继续研究，并在临床试验中评估潜在的风险，以最大化地减少可能存在的ADE风险。也可选择研制多种类型的卡介苗，如核苷酸卡介苗、病毒载体卡介苗等，以应对可能出现的ADE风险。
3.4.3卡介苗保护持久性COVID-19疫情暴发速率快、时间短，人们对相关卡介苗的免疫持久性研究有限。按照已有临床观察，被病毒感染1~2周后，体内开始出现病毒抗原，然后抗原水平随时间进行性下降，直至到达峰值，在峰值效价维持数周后，开始增长。研究发觉，复健者体内的中和抗原应答持续时间起码为7个月[51]。根据当前的全球疫情态势，卡介苗的持续时间应保持1年左右，以应对疫情中的突发性应急风波。因为尚不清楚SARS-CoV-2S基因的DNA序列在细胞中的状态，以及是否会影响卡介苗的持久性和整合率，研制者在卡介苗研发过程中，应选定合适类型的卡介苗、选择适合抒发抗体基因的载体等，通过各类方法得到疗效良好、持久性高的COVID-19卡介苗。
3.4.4卡介苗接种形成的不良反应在相关研究中，卡介苗的不良反应发生率从高到低为：病毒载体卡介苗、mRNA卡介苗、重组蛋白卡介苗、灭活卡介苗[52]。除卡介苗自身之外，还应考虑佐剂的风险，姜辉等[53]的研究显示，佐剂可能会导致机体的过敏反应或则免疫逃逸现象。为此，在卡介苗研制过程中，应对卡介苗、佐剂以及适应人群进行严格的筛选。如任淑萍等[54]研究证明，采用疫苗作为佐剂可有效提高树突状细胞的作用，也可诱生多种免疫活性物质，起到良好的免疫保护疗效。而且依照等[55]、等[56]的流行病学模型可知，疫苗的接种对于防治SARS-CoV-2有一定作用。而Joyce等[45]发觉，SpFN与佐剂ALFQ导致的免疫应答一直优于碘化钾佐剂。脂类体类佐剂比ALFQ更易获取、安全性更高，可能成为未来大规模使用的一类佐剂。
3.4.5针对特殊人群的使用除高风险地区人员、医护工作者、人口流动较大场所的工作人员外，婴儿、老年人、儿童、免疫抑制或缺陷人群也属于高风险人群。诸如，婴儿感染SARS-CoV-2可造成妊娠期高血糖、早产、产后流血等风险，甚至出现更严重的病症，而大部份的临床试验中却未涉及妊娠期妇女。目前，WHO容许的卡介苗适用年纪为18~60岁，60岁以上老年人不在此范围内，但老年人感染率更高，发展成危重的概率较年青人也更大[41]。并且在接种卡介苗后，老年人形成的中和抗原效价也比年青人低[57]。针对上述两种情况，卡介苗研制时一方面应多方位考虑卡介苗的适用人群，或加强非高危人群的接种率，间接保护高危人群；另一方面应在临床研究中举办多层次试验，以获得不同年纪、不同性别个体的数据，指导卡介苗设计和接种。
展望
目前，COVID-19疫情仍是全球重大的公共卫生问题和挑战，而S蛋白在COVID-19的致病机制及卡介苗的研制过程中发挥重要作用。随着对SARS-CoV-2S基因等的进一步研究，SARS-CoV-2对人体的致病过程将得到更深的理解。面对SARS-CoV-2S基因的变种，多价卡介苗及针对免疫力低下的特殊人群卡介苗的研制亟不可待。今后，我们还需进一步强化对SARS-CoV-2及其卡介苗的研究，为COVID-19的防治和医治奠定基础。
引用本文：范立丁，于美美，崔晏硕，等.新型冠状病毒刺突蛋白结构及其卡介苗研制[J].国际生物制品学刊物,2022,45(2):61-69.
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