2022年4月29日，来自加洲学院戴维斯校区的B.院长课题组在刊物上发表了一篇关于借助抗原介导的针对膜蛋白互作的物理毗邻标记方式，可以在原位发觉与鉴别膜蛋白互作的蛋白组。文章标题为“Afor–oncell”。（原文链接：doi:）
跨膜和膜系蛋白占人类蛋白质组的30%以上细胞膜蛋白，在细胞通信和讯号调节，物质交换等生物过程中必不可少。且膜蛋白是超过一半抗生素的靶标，在人体中发挥着至关重要的作用。而其中许多细胞过程，包括细胞讯号传导和膜运输，都涉及复杂的蛋白质-蛋白质互相作用，以达到共同完成生理功能的目的。[1]
通过传统的pull-down技术来研究膜蛋白互作具有较大的挑战。膜蛋白跨膜区的疏水特点，以及膜蛋白提取条件的复杂性，和膜受体与其下游讯号蛋白之间的瞬时或弱互相作用，都促使膜蛋白互作的鉴别困难重重。[2]据悉，因为完整脂单层的破坏，纯化后的膜蛋白无法反映其在真实环境中的互作情况。
烷基自由基是一种蛋白标记官能团，其可以与蛋白的基团位点，如苄基与烷烃，发生反应，形成质量变化，并通过质谱测量到。[3]而则是一种常用的甲基自由基标记探针，其由一个EDTA螯合的铁离子，和溴甲基苯基联接单元组成。能将铁离子固定到目标蛋白上，而铁离子在二溴化氢存在的条件下形成烷基自由基，对附近的蛋白进行标记，以达到临近标记的功能。[4]
作者借助该探针，设计了一种基于抗原的膜蛋白毗邻标记方式，用标记抗原，通过抗体-抗原的特异性亲和将探针定位至诱饵蛋白附近，并标记周围的与诱饵蛋白互作的蛋白，再通过质谱测量即可得到膜蛋白的互作蛋白质，如图1所示。作者将该方式命名为AAPL（–），并对其进行了一系列测试与应用。
图1AAPL方式示意图
作者设计了两种针对抗体的探针联接方案，第一种方式（图2A），是将探针特异性地联接至抗原Fc端的糖基化修饰处；而第二种FeAb（图2B），则是随机将探针联接至抗原的酪谷氨酸残基上。而后文章对这两种联接策略进行了应用与验证。
图2两种探针标记策略与其对应疗效
以前的研究早已得到最优的氧化标记条件，在此基础上细胞膜蛋白，作者选择了膜蛋白与ERBB2作为研究对象。ERBB2蛋白是一种受体酪谷氨酸蛋白激酶，其在20-30%的甲状腺癌中被观察到过度抒发，并造成下游调控的激活。[5]而是Na+/K+的一个催化亚基，被发觉在多种肿瘤组织中失调，也是多种强心苷类抗生素的靶向[6]。作者选择了对应这两种膜蛋白的特异性抗原，对两种探针标记方式的好坏进行了探究。如图2C所示，在不同标记条件的M1-M6实验组中，技巧所在的M5组，与C1-C3组的对照组样本相比，显示了最大的氧化标记差别，证明了该条件的优势。而且在图2C一侧的-ERBB2组中，实验组与对照组样本并未有显著差别，说明针对的抗原，并未辨识ERBB2蛋白，证明了技巧的特异性。确认无误后，作者对方式鉴别的确切性进行了剖析。
图3AAPL与打分的交叉剖析
作者对其所得的氧化蛋白质组数据进行了深度剖析，将各个氧化肽所对应蛋白的氧化程度与产率进行综合测算，得到AAPL评分。该评分反映该蛋白与诱饵蛋白的互作程度，并选出互作蛋白中打分较高的L1与L2组。而后通过将L1与L2组的数据与评分比较，对技巧与AAPL分数的可效度进行了验证。
作者借助对蛋白间的互作程度进行评分，并将评分所鉴别到的蛋白分为T1-T4类，其与诱饵蛋白的互作相关度逐级升高，并把评分与APL评分数据进行交叉剖析（图3）。结果表明，和AAPL方式将相像的蛋白鉴别为与诱饵蛋白的强互相作用因子，验证了打分方式的可靠性。
图互作蛋白网路与糖基化对互作的影响
接出来，作者对AAPL方式进行了三个应用测试。首先，作者针对先前选择的和ERBB2，以及新选择的LI-钙黏蛋白CDH17（图4A），勾画了互作蛋白网路图谱，并与已有的研究进行比较，侧面印证了技巧的确切性。而后，作者就糖基化对蛋白互作的影响展开了研究，Kif()有推动高甘露糖N-聚糖在膜蛋白上抒发的疗效，而SI(3Fax-)则有增加唾液酸化聚糖产率的能力，作者使用这两种药剂分别处理细胞，并进行了针对CDH17蛋白的互作鉴别（图4B）。结果显示，与对照组相比，联接有高比列的高甘露糖聚糖的NOMO2与STT3A蛋白，在加入了Kif后，互作显著强化；而联接有唾液酸化聚糖的CEAM1、ATLA3、1AO2和VTNC，则是遭到了SI的影响，证明了糖基化确实对蛋白互作存在影响。
综上，作者构建了一种基于抗原的膜蛋白物理毗邻标记方式AAPL，对其进行了验证与应用测试，勾画了膜蛋白的蛋白互作网路图。对于该方式，就重要性上而言，膜蛋白占蛋白总量的30%，起到多种受体，离子通道，细胞通信等作用，是多种抗生素的靶向，功能复杂。膜蛋白的互作在其发挥功能的过程中至关重要，是其正常行使功能的基础，故，针对其的研究方式必不可少。但是，膜蛋白的研究仍然具有挑战性，传统方式如亲和纯化，因为膜蛋白无法提取纯化，因而鉴别困难。而且膜蛋白离开质膜环境后，其环境与生物活性改变，类似脂类体等代替方式无法反映其真实生理环境。而AAPL方式，确实地鉴别到了抗体在细胞膜上的互作蛋白，并从多方位验证了其确切性，证明了可行性。就通用性来讲，AAPL方式利用抗体辨识底物，可研究的蛋白质范围较广，且无需对样本进行基因操作，可以运用于多种生物样本与生理调控过程。同时，AAPL方式也具有一定的局限性，其氧化肽未经富集，在复杂样本中鉴别较为困难，且深受质谱的精确度影响，具有一定的随机性，且对于得到的互作蛋白未进行进一步互作的生化验证。而在拓展性的方面，AAPL方式可以用于多种抗生素或细胞分化的互作变化及生理调控的鉴别，在抗生素研究方面有广泛的前景。且该方式可以对无法进行基因操作的样本，如病理组织等，进行鉴别，可以在临床样本中发挥一定的功效。
[1]HonkeK,N.The‐of:anewtoofagivenin[J].of,2011,116(5):690-695.
[2]WuG,M,PR.of-oncellby[J].,2017.
[3]WangL,MR.massofusingbased[J].2011.
[4]ChealSM,NgM,B,etal.−by:ofthereachof[J].,2009,48(21):4577-4586.
[5]HsuJL,HungMC.TheroleofHER2,EGFR,andotherin[J].and,2016,35:575-588.
[6]K,A,T,etal.TheoftheofNa+/K+-istotumorandin[J].,2021,24:1278-1292.