在设计用于活细胞成像研究的光学显微镜系统时，主要考虑诱因是测量器灵敏度（频域）、所需的图象采集速率和样本活力。在使用活细胞时，必须严格防止在记录固定细胞和组织的图象时一般使用的相对较高的光硬度和较长的爆光时间（其中光漂白是主要考虑诱因）。几乎在所有情况下，活细胞显微镜都代表了实现较佳图象质量和保持细胞健康之间的折衷。
原则上，理想的活细胞图象采集系统应当足够灵敏，可以从弱萤光标本中采集优质图象，同时足够快以记录所有动态过程。据悉，该系统将具有足够的帧率来捕捉精细的样本细节和才能确切检测微小的硬度差别的宽动态范围。并且，假如优化这种标准中的任何一个都是以牺牲其他标准为代价的。因而，目前不可能设计出适宜所有可能研究范围的通用活细胞成像系统。反倒，研究人员必须通过确定较重要的优化参数来作出妥协，同时依然企图限制这些被觉得不太感兴趣的变量所作出的牺牲。较后，显微镜配置较终取决于成像模式的要求、在实验过程中保持标本活力的必要性、标记合同的难度级别以及设备的可用性。
活细胞成像技术
活细胞成像是在光学显微镜中使用广泛的对比度提高成像模式进行的。大多数研究涉及某种方式的萤光显微镜，一般与一种或多种透射光技术相结合。诸如：萤光技术包括传统的宽场落射萤光、激光扫描共聚焦、旋转盘和扫场共聚焦、多光子、全内反射(TIRF)、荧光相关波谱、寿命成像(FLIM)、光活化和激光捕获。作为一个子集，它包含：波谱成像、多色成像、共定位、延时序列、光漂白恢复技术（FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量转移(FRET)、散斑显微镜(FSM)和膜片钳一般与一种或多种主要成像模式耦合。萤光技术可以辅以传统的明场模式，包括微分干涉对比(DIC)、霍夫曼调制对比(HMC))和相位对比，作为萤光探针定位的确认。在几乎所有情况下，每种显微镜配置都须要一些奇特的考虑诱因，这种诱因必须施行能够成功进行活细胞成像。无论采用何种显微镜和数码单反系统对活细胞和组织进行成像，两个较重要和限制诱因是维持细胞活力和实现低于背景噪音和自发萤光的可能讯号水平。
活细胞成像中的杂讯
固定细胞成像和活细胞成像之间的根本区是：固定细胞成像为研究人员提供了足够的空间来定义图象采集参数，比如定位合适的视场和确定爆光时间，以及调整电子增益设置、读出率和偏斜值。为此，在大多数情况下（使用充分染色的固定标本）可以获得借助单反系统的全动态范围的图象，因而形成较佳的码率。因为维持细胞活力的严格要求对成像参数的限制，活细胞的情况会有所不同。对于获得的活细胞图象，样本的硬度一般只比背景的硬度高几个灰度级。在这些情况下，侦测器系统的暗电压和读取噪音水平成为细胞成像所必要考虑的条件。经济型单反一般具有较高的噪音水平，这样会造成背景图象不太均匀，一般会掩藏来自样本的讯号，随着读出速率的提升，这些影响会显得愈发严重。所以在几乎所有活细胞成像应用中，检查器的选择对于决定实验的胜败至关重要。
虽然倒置显微镜可以观察活细胞吗，数字成像中的四个主要噪音源来自侦测器、照明系统、泊松噪音或散粒噪音（因为光子通量的随机性）和杂斜视。在大多数情况下，可以通过仔细选择测量器和优化照明条件来系统地减少噪音。几乎每种类型的光子侦测器就会在设备记录的每次检测中引入某种方式的噪音。激光扫描和多光子显微镜中使用的光电倍增管可以在讯号放大系统内形成杂散电子。
为了克服传统高性能CCD单反在须要在极低光照水平下快速捕捉帧速率的应用的缺点，制造商推出了一种创新方式，用于放大CCD读取本底噪音以上的微弱讯号。通过集成片上倍增增益寄存器，电子倍增元件(EMCCD)以低得多的成本实现了提高型或电子轰击CCD典型的单光子检查灵敏度，而且不会影响传统CCD构架的量子效率和帧率特点。
活细胞成像对细胞显微镜光学系统的要求
针对活细胞成像应用的显微镜必须配备由结实的复合材料或铝质成的高质量框架，但是应当通过牢靠地安装在无震动平台上来稳定。外部光学表面以及组件壳体（聚光镜、灯箱、物镜转盘等）应保持清洁状态，显微镜周围的环境应无尘且相对温度较低。活细胞成像持续须要的常规程序之一是使用科勒照明原理确保显微镜光学路径和光阑对齐。
活细胞成像较关键的方面可能是实现较佳放大倍率，同时在实验过程中平衡讯号硬度（有利于低倍率）、分辨率（有利于更高倍率）和细胞活力。研究人员使用时注意耗尽可能少的透镜器件将光学放大倍率与侦测器的象素大小相匹配。具有多种中间放大倍数的晶闸管合器可在市场上买到，以满足光限制和高帧率应用的特定目镜要求（放大倍率和数值孔径）。在选择显微镜目镜放大倍率时，应严格考虑奈奎斯特帧率标准。
活细胞成像常用的标准显微镜目镜是10x和40x（干），以及40x、60x和100x油浸或水浸版本。经济的湿式低倍率镜头主要用于样品的初步扫描以定位感兴趣的区域，而且不须要高光学校准因子。而浸入透镜应具有高数值孔径（油为1.3至1.45，水为1.2）和高透光效率。因为图象一般集聚在视场中心附近，因而高度校准以形成平坦视场的目镜一般不会提供可测量的用处，但是与校准较少的目镜相比，成本显著更高且光效更低。
冷却单色sCMOS和CCD单反是大多数涉及培养中活细胞的成像应用的适合选择，无论是落射萤光还是具有对比度提高（DIC和相差）的透射光是主要采集模式。在选择单反时，要考虑的重要参数包括量子效率、噪声水平（暗电压和读数）、像素大小（以及相关的全阱容量）和扫描频度。为了尽量减低撞击样品的迸发光水平，单反应尽可能灵敏，这一般意味着高量子效率、低噪音、大象素规格和慢扫描速度。
慢扫描CCD单反的帧速率一般遭到限制，除非样品具有极亮的萤光，否则当爆光时间短时占空比会差。这限制了这种单反系统在高速成像应用中的使用（范围高达每秒30帧），并妨碍了对样本进行聚焦的尝试。在定位合适的标本和聚焦单反时，应尽量避开光漂白和光毒性，这种伪影会影响细胞活力和色温。在这方面倒置显微镜可以观察活细胞吗，应选择具有无快门、帧传输的EMCCD装置或行间CCD传感的单反，这种传感不仅还能提供慢速扫描数字讯号外，还能否以视频速度提供连续的图象流。
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